SBI CAS720A-KIT說明書

上海起發為(wei) System Biosesciences特約經銷商，System Biosesciences,簡稱SBI，美國加州灣區新成立的生技公司，致力於(yu) *、創新生物技術之開發，以研發利於(yu) 基因及蛋白質功能鑒定、研究之嶄新方法和工具為(wei) 宗旨。 現階段研發重心為(wei) RNA幹擾（RNAi）研究之相關(guan) 工具。 System Biosesciences (SBI) 致力於(yu) 開發*、革新的技術，為(wei) 客戶研究蛋白組學和基因組學功能提供研究工具。SBI 是專(zhuan) 業(ye) 的慢病毒產(chan) 品公司，提供基於(yu) 慢病毒的所有相關(guan) 產(chan) 品、質粒、試劑盒及相關(guan) 配套試劑和慢病毒延伸產(chan) 品如IPS細胞多功能性誘導試劑盒和RNAi篩選文庫。

SBI CAS720A-KIT說明書(shu)

品牌：System Biosesciences

貨號：CAS720A-KIT

品名：-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNucleaseTM Plasmid & Multiplex gRNA Cloning Kit

產品信息

增強您的一體(ti) 化Cas9 SmartNuclease質粒與(yu) 多路複用gRNA傳(chuan) 遞

通過將CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA一體(ti) 化Cas9 SmartNuclease TM質粒與(yu) Multiplex gRNA克隆試劑盒相結合，輕鬆提高功能。總之，這兩(liang) 種產(chan) 品可以實現更廣泛的需要多種gRNA的複雜基因組編輯項目。

您可以獲得CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNuclease質粒的所有優(you) 點：

• 方便地提供Cas9和gRNA與一個單一的載體
• 用CAG啟動子驅動Cas9表達，其在原代細胞和幹細胞中提供高表達水平
• 從H1啟動子表達gRNA以獲得較大特異性並選擇靶標
• 確保有效利用N期和C期核定位信號（NLS）將Cas9導入細胞核
• 在C-term NLS之後通過WPRE調控元件促進Cas9基因表達並穩定轉錄本
• 用N-term myc-tag輕鬆檢測和/或純化Cas9蛋白
• 使用T7啟動子通過體外轉錄產生Cas9 mRNA

結合Multiplex gRNA克隆試劑盒的優(you) 點：

• 一次編輯多個基因座，節省時間和試劑
• 容易產生多順反子gRNA表達構建體
• 適用於Cas9切割酶應用
• 非常適合研究信號通路

正如我們(men) 所有的Cas9交付選項一樣，CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA質粒在功能上得到了驗證，並得到了我們(men) 的專(zhuan) 家團隊的支持 - 如果您有基因組工程問題，隻需通過電子郵件tech @ systembio發送問。 com。

為(wei) 什麽(me) 建議使用人力資源定位向量

盡管單獨由Cas9引起的DSB可導致基因敲除，但SBI建議使用HR靶向載體(ti) （也稱為(wei) HR供體(ti) 載體(ti) ）以實現更有效和的突變。人力資源捐助者可以提供正麵或負麵選擇的要素，以確保更容易識別成功的突變事件。此外，HR供體(ti) 可以包含高達6-8 kb的開放閱讀框用於(yu) 基因敲入或標記，並且當5'或3'同源臂中包含小突變時，可以進行特定的靶向基因編輯。

使用此表格選擇適合您的CRISPR / Cas9產(chan) 品：

使用SBI的一體(ti) 化Cas9 SmartNuclease質粒和Mulitplex gRNA克隆試劑盒

工作流程一目了然  

圖1. Multiplex gRNA克隆試劑盒工作流程。

使用Multiplex gRNA克隆試劑盒準備您的多重gRNA插入片段（圖1）

PrecisionX Multiplex gRNA克隆試劑盒提供H1和U6啟動子區域，可輕鬆構建多個(ge) gRNA盒（圖1）。在步驟1中，將含有所需gRNA（由用戶設計）和腳手架 - 啟動子區段（來自試劑盒）的重疊末端的引物在PCR反應中合並以產(chan) 生含有兩(liang) 種gRNA的PCR擴增子。在步驟2中，將PCR擴增子與(yu) 融合反應混合物一起與(yu) 用於(yu) 無縫構建的線性化表達載體(ti) 組合。

• 轉化到感受態細胞中並在LB /卡那黴素平板（50μg/ ml）中生長
• 通過直接測序確認陽性克隆
• 使用標準轉染方案將經過序列驗證的一體化構建體轉染到哺乳動物細胞中（如果您的應用需要，與HR靶向載體共轉染）
• 進行Surveyor核酸酶測定（或其他適合的錯配切割測定）以檢查位點特異性基因組切割並選擇期望的克隆

用CRISPR / Cas9進行基因組工程

有關(guan) 使用CRISPR / Cas9技術進行基因組工程的一般指導，請查看我們(men) 的CRISPR / Cas9教程以及以下應用筆記：

CRISPR / Cas9基因敲除應用簡報（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因編輯應用簡報（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因標簽應用簡報（PDF）»

CRISPR / Cas9基礎

通過仔細選擇靶序列和設計供體(ti) 質粒進行同源
重組，您可以使用CRISPR / Cas9實現且高度靶向的基因組修飾。

係統

Cas9蛋白質 - 指導RNA（gRNA）指導位點特異性雙鏈切割，與(yu) 目標中的原型銜接子基序（PAM）相鄰。

引導Cas9切割靶基因組中的同源區域的gRNA- RNA序列。僅(jin) 當gRNA同源性與(yu) PAM相鄰時才有效切割。

PAM- prototospacer銜接子基序NGG是目標序列，如果指向gRNA，spCas9將從(cong) 上遊切除。

工作流程一目了然

設計：選擇gRNA和HR供體(ti) 質粒。選擇gRNA位點並設計供
體(ti) 質粒決(jue) 定同源重組事件是否導致敲除，
敲入，編輯或標記。

構建：將gRNA克隆到一體(ti) 化Cas9載體(ti) 中。將5'和3'同源臂克隆到HR 
供體(ti) 質粒中。如果創建基因敲入，將所需基因克隆到HR供體(ti) 中。

共轉染或CO-INJECT：介紹Cas9，gRNA和HR捐贈者進入靶細胞
使用共轉染質粒，共轉導為(wei) 慢病毒，或共注射的mRNA。

選擇/屏幕：選擇或篩選突變體(ti) 並驗證。

VALIDATE：基因型或序列推定的突變體(ti) ，以驗證單個(ge) 或雙等位基因轉化。

在多個(ge) 基因組位置同時進行編輯

請注意，本研究使用略有不同的All-in-One Cas9 SmartNuclease質粒設計，但預期結果相似。

圖2. Multiplex gRNA克隆試劑盒可以有效地提供四種gRNA。 （A）我們(men) 使用了使用Multilplex gRNA克隆試劑盒和All-in-one Cas9 SmartNickase載體(ti) 創建的四重gRNA，以從(cong) 具有穩定整合的CMV的細胞係中去除（B） 1260bp的GFP-T2A-RFP區段-GFP-T2A-RFP表達盒。我們(men) 將這四種gRNA克隆到Cas9 SmartNickase載體(ti) （EF1Nickase-H1-gRNA）中以指導兩(liang) 個(ge) 雙切口事件 - 一個(ge) 在GFP的5'末端，另一個(ge) 在RFP基因的3'末端。（C）使用僅(jin) 在GFP和RFP基因外部的引物進行的PCR測定在不存在SmartNickase載體(ti) （泳道1）的情況下產(chan) 生1600bp片段，並且在存在Cas9SmartNickase-4gRNA構建體(ti) （泳道2）的情況下產(chan) 生340bp片段，證明SmartNickase介導的配對雙切口和GFP-T2A-RFP基因組缺失的效率。（D） GFP和RFP活性的缺失也可以在功能測定中看到，通過降低GFP和RFP熒光。

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