BioCheck，Inc。為(wei) 醫療保健市場和研究市場開發，製造和分銷免疫診斷檢測試劑盒和研究試劑。
我們(men) 的新產(chan) 品包括用於(yu) 研究應用的兔單克隆抗體(ti) ，用於(yu) 小鼠和人類Id1，Id2，Id3和Id4蛋白，抗體(ti) 用於(yu) HMGA2的研究應用。
BioCheck pd-1酶免疫測定試劑盒說明書(shu)
PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT
pd-1酶免疫測定試劑盒
Enzyme Immunoassay for the Quantitative Determination of PD-1 Concentration in Human Serum and Plasma
酶免疫法定量測定人血清和血漿中Pd-1濃度
目錄編號：bc-1301
隻作研究用途，而非用於(yu) 診斷程序。
介紹
程序性細胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一種細胞表麵受體(ti) ，對調節T細胞炎症活動和維持外周免疫耐受至關(guan) 重要。 係統(1)。pd-1可以與(yu) 配體(ti) pd-l1和pd-l2相互作用。pd-1具有胞外IGV結構域、跨膜結構域和帶有兩(liang) 個(ge) 磷酸化位點(shp-1和shp-2)的胞內(nei) 尾。 下調免疫係統，抑製T細胞活性(2)。抗原識別後，活化的T細胞在其表麵表達pd-1，產(chan) 生幹擾素，誘導P的表達。 d-L1，從(cong) 而促進細胞凋亡或細胞死亡。(3)當pd-1配體(ti) 被腫瘤細胞劫持時，其異常表達抑製了免疫調節T細胞的活化，導致疾病進展。 <物>離子 (4).
血清和血漿中Pd-1水平升高與(yu) 類風濕關(guan) 節炎和皮膚硬化有關(guan) (5，6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤的T細胞(7)表達.進一步再 研究表明，使用針對pd-1免疫檢查點的單克隆抗體(ti) 有助於(yu) 在理解和治療黑色素瘤和其他內(nei) 翻等癌症方麵取得突破性進展。 非小細胞肺癌(4)。
測定原理
pd-1酶聯免疫吸附試驗是以固相酶聯免疫吸附試驗為(wei) 基礎的.該檢測係統利用一種*的單克隆抗體(ti) 對，針對一種*的抗原性測定方法。 Pd-1分子上的螞蟻。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體(ti) 進行固相固定(在微滴度井上).另一種與(yu) 辣根結合的單克隆抗pd-1抗體(ti) H過氧化物酶(HRP)存在於(yu) 酶的共軛溶液中。測試樣品被允許與(yu) 這兩(liang) 種抗體(ti) 順序反應，導致pd-1分子被夾在固體(ti) p之間。 Hase和酶聯抗體(ti) 。在室溫下進行兩(liang) 次單獨的60分鍾孵育後，用洗滌緩衝(chong) 液衝(chong) 洗水井，除去未結合的標記抗體(ti) 。TMB試劑添加了一個(ge) ND在黑暗條件下孵育20分鍾，形成藍色。隨著停止解決(jue) 方案的添加，顏色開發停止，將顏色更改為(wei) 黃色。這，這個(ge) ，那，那個(ge) Pd-1濃度與(yu) 樣品的顯色強度成正比.在450 nm處分光度法測定吸光度。
試劑準備
所有試劑在使用前應允許達到室溫(18-25°C)。
2.對於(yu) 每次測試運行，準備一個(ge) 新的標準集。
3.用標準/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標準/樣品稀釋劑製備10 ng/mL標準的雙倍係列稀釋劑：
a.10 ng/mL：0.12mL 50 ng/mL，0.48mL標準品/樣品稀釋劑b。5 ng/mL：0.25mL 10 ng/mL標準品/樣品稀釋劑c。2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標準品/樣品 稀釋劑d.1.25 ng/mL：0.25 mL，2.5 ng/ml，0.25 mL標準品/樣品稀釋劑e。0.625 ng/mL：1.25ng/mL標準品/樣品稀釋劑f的0.25ng/mL。0.313 ng/mL：0.25mL，0.625 ng/mL 0。 25 mL標準/樣品稀釋劑
h.0.156 ng/mL：0.25mL，0.313 ng/mL，0.25mL標準稀釋劑I。0 ng/mL：0.25 mL標準稀釋劑
病人樣本在使用前需要稀釋4倍。製備一係列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與(yu) 180 L標準/樣品稀釋劑混合。
6.工作洗滌緩衝(chong) 器：從(cong) 20倍庫存中製備1倍洗滌緩衝(chong) 液。加入50毫升的20倍洗滌緩衝(chong) 液庫存到950毫升的直接水。工作洗滌緩衝(chong) 液在2~8°C溫度下穩定運行30天.注：任何水晶 由於(yu) 高鹽濃度而可能出現的S，必須在室溫下重新溶解，然後再進行稀釋。
檢測程序
準備標準。見試劑準備。
稀釋樣品1：4稀釋。見試劑準備。
確保所需數量的塗層井在保持架。
配發Pd-1標準的100mL，並將樣品稀釋到適當的井中.
室溫(18-25°C)孵育60 min.
將培養(yang) 皿中的內(nei) 容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩衝(chong) 液衝(chong) 洗微滴水井5次。把水井打到吸水性紙或吸塵器上。 用毛巾去除所有殘留的水滴。
將Pd-1工作酶結合劑的100mL配伍到每口井中.
8.室溫(18-25°C)孵育60 min.
9.將培養(yang) 皿中的內(nei) 容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩衝(chong) 液衝(chong) 洗微滴水井5次。把水井打到吸收紙上或 紙巾去除所有殘留水滴。
10.在每口井中分配100mL TMB溶液。
11.室溫(18-25°C)孵育20分鍾.
12.通過在每口井中加入100mL的停止溶液來停止反應。
13.輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍色*變成黃色。
14.在450 nm處讀取吸光度，15分鍾內(nei) 使用微滴度良好的閱讀器。
統計
計算每組參考標準、對照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。
通過繪製每個(ge) 參考標準的平均吸光度(以納克/毫升為(wei) 單位)繪製在圖表紙上，並在垂直(Y)軸上繪製吸光度，從(cong) 而構造一條標準曲線。 在水平(X)軸上的比率。
用每個(ge) 樣品的平均吸光度值，從(cong) 標準曲線上測定相應的Pd-1濃度(ng/mL)。取決(jue) 於(yu) 經驗和/或計算機的可用性 能力，可以采用其他的數據縮減方法。
4.樣品的檢出值應乘以稀釋倍數為(wei) 4，得到Pd-1的結果為(wei) ng/ml。
標準曲線實例
一個(ge) 典型的標準運行結果，吸光度讀數在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-1濃度顯示在X軸上。注：本標準曲線為(wei) 圖示目的。 僅(jin) 用於(yu) 計算未知數，不應用於(yu) 計算未知數。每個(ge) 實驗室必須在每個(ge) 實驗中生成自己的數據和標準曲線。
工作特性
從(cong) 零標準的平均值用2SD法測定的Pd-1ELISA低可檢出濃度為(wei) 0.15ng/ml。
精度a.在一次測定中，通過對三種不同樣品的重複測定，確定了內(nei) 測精密度.批內(nei) 可變性如下所示：
b. 在一係列單獨校準的測試中，通過對三個(ge) 不同樣本的重複測量，確定了運行間精密度。試驗間的可變性顯示為(wei) 貝爾。 表示突然疼痛所發出的聲音
3、回收率和線性研究。回收樣品加入已知的Pd-1水平，並一式兩(liang) 份進行測定。平均回收率為(wei) 105.3%。
b.對三個(ge) 樣品進行連續稀釋，以確定線性度。平均回收率為(wei) 99.6%。
REFERENCES
7. Ahmadzadeh, M., Johnson, L. A., Heemskerk, B., Wunderlich, J. R., Dudley, M. E., White, D. E., & Rosenberg, S. A. (2009). Tumor antigen–specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood, 114(8), 1537–1544
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