zeptometrix 0801008說明書

zeptometrix  0801008說明書(shu)  

HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0

預期用途
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0是一種用於(yu) 檢測人類免疫缺陷的酶聯免疫分析方法。
細胞培養(yang) 基中的病毒1型（HIV-1）p24抗原。它可用於(yu) 監測
HIV-1或測定基於(yu) HIV-1的慢病毒樣本的滴度。因為(wei) p24的氨基酸序列在
不同的HIV-1分離株，本試驗檢測了來自HIV-1亞(ya) 型a-f的p24。對人類沒有交叉反應。
免疫缺陷病毒2型（HIV-2）、猴免疫缺陷病毒（SIV）或人類T細胞白血病病毒I型和II型
（htlv i和ii）p24或任何gag基因產(chan) 物。
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0僅(jin) 供研究使用。不用於(yu) 診斷程序。
試驗原理
微孔板上覆蓋著一種單克隆抗體(ti) ，該抗體(ti) 對HIV-1的p24 gag基因產(chan) 物具有特異性。HIV-1 p24抗原
在樣品培養(yang) 期間，將樣品特別捕獲到固定抗體(ti) 上。然後捕獲的抗原
與(yu) 人抗HIV-1抗體(ti) 結合辣根過氧化物酶（HRP）反應。在隨後添加
底物，顏色隨著HRP酶的反應而發展。合成的光密度與(yu) HIV-1 p24的量成正比。
樣本中存在抗原。然後繪製一組標準稀釋液的吸光度值。p24的量是
通過點到點圖的插值或標準曲線的線性回歸分析確定。
試劑
供應材料：
•用於(yu) 96次測定的HIV-1 p24抗體(ti) 塗層微孔板，5個(ge) 平板：12x8井條。塗有鼠藥的水井
抗HIV-1 p24的單克隆抗體(ti) 。
•HIV-1 p24檢測抗體(ti) ，5 x12 ml：含有HRP（辣根過氧化物酶）-與(yu) HIV-1結合的人抗體(ti)
從(cong) HIV-1人源材料中純化。
•HIV-1 p24抗原標準，5 x 0.5 ml：含有來自山羊HIV-1 IIIB的被破壞的、熱滅活的病毒抗原。
血清，Triton X-100®，疊氮化納。
•溶解緩衝(chong) 液，5 x 5 ml:Triton X-100®在PBS和2-氯乙酰胺中。
測定稀釋劑，5×100毫升：含有山羊血清，PBS，Triton X-100®，和2-氯乙酰胺。
•10x洗板緩衝(chong) 液，5 x 125 ml：含有PBS、Tween 20®和2-氯乙酰胺。
•基質，5 x 12 ml：含有四甲基聯苯胺（TMB）。
•微孔板封閉劑（1 pk）：每包10個(ge) 封閉劑
•停止溶液，5 x 12 ml：含有鹽酸（HCl）。
•封板劑：5 x10
•可再密封塑料袋：5個(ge)
？Triton X-100是Union Carbide Chemicals and Plastics Co.，Inc.的注冊(ce) 商標。Tween 20是
帝國化學工業(ye) 的商標。

存儲(chu)
將所有試劑盒儲(chu) 存在2°-8°C的溫度下。不要冷凍。當正確存放時，該套件在包裝盒上注明的日期前是穩定的。
標簽。
所需但未提供的材料：
•一次性手套
•經驗證的可調節微量移液管，單通道和多通道
•用於(yu) 製備樣品和控製稀釋的試管和試管架
•量筒和各種燒杯
•經驗證的自動微孔板清洗機或手動真空抽吸設備
驗證培養(yang) 箱溫度為(wei) 37°C±1°C
•經驗證的微孔板讀卡器
計時器
•1%次氯酸鈉作為(wei) 消毒劑。可由家用漂白劑製成
•蒸餾水或去離子水
注意事項
僅(jin) 供研究使用。不用於(yu) 體(ti) 外診斷。
•進行分析前，仔細閱讀所有說明。
•使用通用預防措施處理套件組件和試樣。
•為(wei) 避免交叉汙染，對每個(ge) 樣品使用單獨的吸管頭。
•當測試潛在感染性人體(ti) 樣本時，遵守所有適用的地方、州和聯邦法規。
關(guan) 於(yu) 生物有害物質的處理。
•HIV-1 p24抗原標準含有疊氮鈉作為(wei) 防腐劑。疊氮化納可能與(yu) 鉛或銅管發生反應。
形成爆炸性的金屬疊氮化物。處理後用大量水衝(chong) 洗管道，以防止疊氮化物在
排水溝。
•停止溶液含有鹽酸，可能導致嚴(yan) 重燒傷(shang) 。如果接觸到眼睛或皮膚，請衝(chong) 洗
立即用水並尋求醫療救助。穿防護服和護目鏡。
•用於(yu) 製造HIV-1檢測儀(yi) 抗體(ti) 的人源材料已經過測試，結果為(wei) 陰性。
乙型肝炎表麵抗原。用於(yu) 製備HIV-1 p24抗原標準的病毒裂解液已被
化學破壞和加熱。把這些試劑當作能傳(chuan) 播傳(chuan) 染源的試劑來處理。
•盡管p24抗原保存良好，但一些HIV-1分離株和重組克隆可能表現出輕微的反應性。
與(yu) HIV-1 p24抗原標準相比的差異包括該試劑盒。

試劑的製備
•使用前將所有試劑置於(yu) 室溫。
•洗板緩衝(chong) 液：使用前，將10倍洗板緩衝(chong) 液1:10在蒸餾水或去離子水中稀釋。1X洗板緩衝(chong) 器
可在2°-8°C下儲(chu) 存1周。10倍洗板緩衝(chong) 液（目錄：0801060）的附加瓶可
命令。
•洗板：將洗板機或其他點膠設備的點膠量設置為(wei) 至少350微升或高達
可能不會(hui) 溢出微孔板。這將確保*洗井並防止潛在的
由移液管或板密封件拆卸過程中可能發生的試劑飛濺引起的信號背景。
•試驗準備：標記用於(yu) 製備標準和樣品的試管。在每條帶子的末端貼上標簽
標簽，以確定試紙條在分析過程中是否與(yu) 板架分離。如果整個(ge) 96孔板
不要使用，從(cong) 板架上取下多餘(yu) 的條帶。將多餘(yu) 的條帶和幹燥劑放入可重新密封的塑料中
包裝、密封並在2°-8°C下儲(chu) 存。
•HIV-1 p24抗原標準：根據HIV-1 p24抗原標準製備一係列六個(ge) 標準。使用稀釋液
表1中的方案。在完成檢測後，任何稀釋的HIV-1 p24抗原標準都應
丟(diu) 棄的。

標準品不需要用溶解緩衝(chong) 液處理。
•試樣：將50微升溶解緩衝(chong) 液移液至450微升樣品中，在試管中處理樣品，並充分混合。
或者，隻要樣品被1/10體(ti) 積的溶解緩衝(chong) 液破壞，就可以使用其他體(ti) 積。未知的
樣品建議製備一套10倍稀釋液，以確保其中一種稀釋液符合標準。
曲線。可以用分析稀釋劑或細胞培養(yang) 基稀釋。處理過的樣品可以長期保存在
-20℃或更低（如有必要） 

試驗程序
步驟1：用350μl 1X洗板緩衝(chong) 液和
抽吸。預洗去除了微孔板穩定劑，是實現均勻和宜反應性的必要條件。
用倒置的微孔板或吸水毛巾墊上的條狀物*吸幹。繼續罷工直到不行
液滴留在井裏。添加樣品前，不要讓洗過的盤子*幹燥。幹燥
會(hui) 對測試結果產(chan) 生不利影響。
第二步：用準備好的標準配置兩(liang) 條帶，如下所示。在
化驗。此井用於(yu) 基板空白。用移液管將200微升的標準品1-6移到重複井和7（0 pg/ml）中。

第3步：用移液管將按照“試劑製備”一節所述製備的每個(ge) 試樣200微升移到重複孔中。
第4步：用平板密封器覆蓋微孔板，並在37°C±1°C下培養(yang) 至少1.5小時或過夜（多24小時）。
孵育時間短可能導致微板邊緣效應。培養(yang) 時間越長，敏感性越高。
步驟5：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
步驟6：用移液管將100微升HIV-1 p24檢測抗體(ti) 移入每個(ge) 孔中，底物空白除外。用一個(ge)
在37°C±1°C下培養(yang) 1小時。
步驟7：如步驟1所述，抽吸和清洗板6次。
第8步：用移液管將100微升基質移入所有培養(yang) 孔中，在室溫（18°-25°C）下培養(yang) 30分鍾。一
在含有病毒抗原的井中會(hui) 出現藍色。
第九步：用100微升停止液移液管將反應停止。將導致顏色從(cong) 藍色變為(wei) 黃色。
第10步：在15分鍾內(nei) ，用一個(ge) 微板閱讀器在450納米處讀取每個(ge) 孔的光密度。

計算和解釋結果
測試有效性：
•0.0 pg/ml標準的光密度不應超過0.120。如果兩(liang) 個(ge) 或更多的井高於(yu) 0.120，則測試
無效。
•125 pg/ml p24標準的光密度值應大於(yu) 1.100，否則試驗無效。
•測試樣品的平均吸光度讀數必須低於(yu) 125 pg/ml，否則必須重新測試樣品。
在更高的稀釋度範圍內(nei) 。如果試樣的平均吸光度讀數低於(yu)
3.9 pg/ml，則p24濃度低於(yu) 分析定量限值。

截止值的確定：
在0.0 pg/ml樣品光學值的平均值上添加0.030的預定係數。這是對
檢測化驗結果。該值是確定截止值的一般準則。或者，更準確的結果可能
通過在一組已知的負樣品的平均光密度中添加至少兩(liang) 個(ge) 標準偏差來獲得。
樣本建立統計截止值。吸光度值大於(yu) 或等於(yu) 截止值但
低於(yu) 3.9 pg/ml的平均吸光度值被認為(wei) 是定性陽性。

要量化HIV-1 p24的水平：
計算每個(ge) p24標準品和試樣的平均吸光度。使用線性圖紙或計算機繪圖
軟件，在X軸上繪製HIV-1 p24抗原標準（pg/ml）的濃度與(yu)
Y軸上的每個(ge) 標準。然後用插值法或線性法測定標本中HIV-1 p24抗原的濃度。
從(cong) 標準曲線進行回歸分析。確保對所有稀釋進行校正，包括在
添加溶解緩衝(chong) 液。供試品吸光度值必須在標準曲線內(nei) 才能準確定量。
病毒滴度（tu/ml）的測定：
慢病毒的每個(ge) 物理粒子（pp）大約有2000個(ge) p24分子：
（2×103）
）x（24 x 103 da，每pp p24），48 x 106
/阿伏加德羅=（48 x 106
）/（6 x 1023）=8 x 10-17g P24/聚丙烯，大約
每1 x 10-16g P24 1 pp，每p24 1 x 104 pp。
一個(ge) 包裝合理的VSV-G假型慢病毒載體(ti) 的感染指數為(wei) 每1000個(ge) 單位1個(ge) 單位。
物理粒子（pp）至1 tu/100 pp（或更小）。因此，p24的範圍約為(wei) 10至100 tu/pg。
精度數據

資料
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