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amquar達克珠單抗

　更新時間：2019-06-05　點擊量：2439

amquar.達克珠單抗

Daclizumab（達珠單抗高產(chan) 法）是一種人源化單克隆抗體(ti) ，可與(yu) 白細胞介素-2受體(ti) 的α-亞(ya) 基（CD25）結合，有利地調節多發性硬化症（MS）的免疫環境。

目錄號

MA1018

純度

> 97％的

規格

2毫克/毫升

  • 生物活性

     

    Daclizumab（達珠單抗高產(chan) 法）是一種人源化單克隆抗體(ti) ，可與(yu) 白細胞介素-2受體(ti) 的α-亞(ya) 基（CD25）結合，有利地調節多發性硬化症（MS）中的免疫環境。

    達克珠單抗與(yu) CD25的結合，Kd值為(wei) 4.5nM。[1]

    Daclizuma在體(ti) 外抑製IL-2依賴的KIT225 / K6細胞增殖，IC50為(wei) 3.14nM [1]。

     

  • 體外研究

     

  • 體內研究

     

  • 激酶實驗

     

    使用表麵等離子體(ti) 共振進行等離子體(ti) 共振結合表征[1]

     

    抗體(ti) 結合特性werecharacterized以確定針對可溶性，重組人IL-2R的結合相互作用速率常數（ka和KD）和親(qin) 和常數（KD） α 使用Biacore技術（CD25）。使用伯胺共價(jia) 偶聯化學將每種抗體(ti) 材料固定在芯片表麵上。使用自動方法以不同濃度一式兩(liang) 份和參照表麵注射重組CD25 2分鍾。使用參考流動池和緩衝(chong) 液空白校正結合數據。使用新製備的傳(chuan) 感器表麵複製測定，然後使用二價(jia) 模型將結合數據與(yu) BIAevaluation軟件擬合以獲得用於(yu) 動力學評估的平衡常數。

     

     

  • 細胞實驗

     

    細胞培養(yang) 和效應細胞的分離[1]

     

    使用基於(yu) 細胞的方法測定直接抑製IL-2依賴性高親(qin) 和力IL-2受體(ti) 介導的增殖的相對抗體(ti) 生物學效力，該方法評估滴定的抗體(ti) 濃度對人白血病細胞係KIT225 / K6.28 PBMC增殖的影響。用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度分離並用作ADCC測定中的效應細胞。在另外的ADCC實驗中，分別使用針對CD14和CD56的EasySepTM人CD34陽性選擇試劑盒從(cong) PBMC培養(yang) 物中除去單核細胞和NK細胞，並使用RobosepTM自動細胞分離係統的製造商方案。通過流式細胞術分析發現靶細胞消耗大於(yu) 95％。所有血液均來自知情同意的健康誌願者，並且未對個(ge) 體(ti) 供體(ti) 進行基因分型。

    51 Cr標記靶細胞

    KIT225 / K6細胞在RPMI 1640*培養(yang) 基（10％熱滅活的胎牛血清加補充物）中生長。KIT225 / K6cells以2×10的終濃度懸浮在0.5毫升試驗培養(yang) 基（RPMI 1640,10％熱inactivatedfetal牛serumplus補充劑）7個(ge) 細胞/ mL，並用500標記的 μ 次的51鉻（50 μ 次/ 10 6個(ge) 細胞）在37溫育Ô在水浴中1個(ge) 小時withoccasional混合℃。用12mL AssayMedium洗滌標記的細胞4次。使用Beckman Gamma5500B計數器靶標記的效率進行評價(jia) ，並認為(wei) 是可接受的，如果有在least20,000 CPM / 10的活動5細胞。標記的靶細胞在測定培養(yang) 基中以2.5×10 5細胞/ mL的細胞密度懸浮，或在CDC測定培養(yang) 基中以5.0×10 5細胞/ mL懸浮，視情況而定。

    補體(ti) 依賴性細胞毒性測定

    將抗體(ti) 在含有RPMI 1640,0.1％BSA和10mM HEPES的CDC AssayMedium中連續稀釋。50 μ 洛夫51 Cr標記的靶細胞（25,000cells /孔）加入到wellsof amicrotiter U型底96孔板中，然後在50體(ti) 積 μ 加入測試抗體(ti) 的LOF係列稀釋。25 μ 升8％的Triton X-100的and25 μ CDC分析培養(yang) 基升加入到大釋放孔中，並50 μ LOF CDC分析培養(yang) 基加入到自發釋放的孔（一式四份）。50 μ LOF 1/3稀釋度的人血清池的溶液中加入於(yu) 參考和testsample井。三分之一稀釋的熱滅活的（30分鍾將50ml在56 öC）將人合並的血清加入補體(ti) 非依賴性對照，大釋放和自發釋放孔中。通過鑒定特異性活性大的濃度而非特異性活性小化來預先建立宜的人合並血清濃度。測定板incubatedfor 2小時，在37 Ô在7.5％CO c ^ 2培養(yang) 箱然後紡at350 RCF在室溫下5分鍾。75的體(ti) 積 μ LOF上清液轉移托米尼管，和eachmini-管插入intoa閃爍小瓶中並計數1分鍾在Beckman伽瑪5500B計數器，或等同物。匯集的人血清使用靜脈穿刺和標準技術從(cong) Quidel Corporation或健康誌願者獲得。

    用於(yu) CDC活性的陽性對照抗體(ti) 是人源化IgG1 / k抗體(ti) Hu＃4，其對於(yu) 跨HLA-DR具有結合特異性。用於(yu) CDC和ADCC活性的陰性對照抗體(ti) 具有對HSV病毒抗原具有結合特異性的人源化IgG1 / k抗體(ti) HuFd79。報告為(wei) 百分比特異性裂解的值使用以下公式得出：特異性裂解百分比=（（抗體(ti) 治療計數每分鍾（CPM） - 自發性CPM）/（大CPM - 自發性CPM））×100。

    抗體(ti) 依賴性細胞介導的細胞毒性測定

    51鉻labeledKIT225 / K6細胞（12500個(ge) 細胞/孔）預溫育以1:1的fixedconcentration μ克/毫升的mAb（用於(yu) 可變效應物與(yu) 靶[E：T]比率格式）orvarious劑量（5,1，0.2 ，0.04％，0.008，和0.0016 μ克/毫升）的mAb（用於(yu) 可變抗體(ti) 濃度格式）處理30分鍾，在4 Ó在100體(ti) 積CIN V-bottom96-孔板 μ大號AssayMedium的。將對照細胞與(yu) 單獨的測定培養(yang) 基（無mAb）一起溫育，隨後確定自發和大51 Cr釋放，以及抗體(ti) 非依賴性細胞介導的細胞毒性（AICC）。將PBMC（效應子）在分析培養(yang) 基中，在單獨的96孔聚丙烯板中連續稀釋，產(chan) 生6.25×10的濃度。5個(ge) 細胞/ 100 μ L，3.13x 10 5細胞/ 100 μ L，1.56×10個(ge) 5細胞/ 100 μ L，7.81x 10 4細胞/ 100 μ L，3.91×10個(ge) 4細胞/ 100 μ L. 100 μ LPER PBMC懸浮液的孔中轉移到變量E：含有T比assayplate 51 Cr標記的KIT225 / K6 + 1 μ克/毫升的mAb，得到E：的T比50：1，25：1，12.5：1，6.25： 1和3.13：1。到variableantibody濃度測定板，將PBMC稀釋至3.13£106細胞/ 100 μ Land100 μ每孔加入到試驗孔中升。100 μ將單獨的Assay培養(yang) 基中的L（無效應物）加入到51 Cr標記的KIT225 / K6C mAb中，以確定51 Cr的自發和大釋放。Theassay平板在50 RCF離心2分鍾，並在37℃培養(yang) Ô CIN 7.5％CO 2培養(yang) 箱中培養(yang) 4個(ge) 小時。4國稅發小時培養(yang) 結束前30分鍾，25體(ti) 積 μ tothe適當的對照孔中加入L 8％的TritonX-100的確定的大釋放51個(ge)  Crfrom靶細胞。ADCC活性的陽性對照抗體(ti) 是對HLA-DR b鏈具有結合特異性的人源化IgG1 / k抗體(ti) Hu1D10。

    抑製IL-2依賴性增殖

    使用需要IL-2增殖的人KIT225 / K6細胞係測定Zenapax和DAC HYP的相對效力。在微量滴定組織培養(yang) 板中在IL-2存在下針對單位體(ti) 積的細胞滴定抗體(ti) ，並使用530nm激發和590nm發射波長測定Alamarblue的減少。通過繪製相對熒光單位對log10濃度來確定陽性。產(chan) 生S形曲線的值，並使用SoftMax Pro 4.3軟件中的4參數擬合進行評估。

     

     

  • 動物實驗

     

    ATL的小鼠模型[2]

     

    ATL細胞群MET-1從(cong) 患有急性ATL的患者的外周血中建立，並且通過NOD / SCID小鼠中的連續轉移維持細胞。MET-1細胞具有通過熒光激活細胞分選分析闡明的暗色表型：CD3 dim，CD4 + / - ，CD7 -，CD20 - 和 CD25 +。通過腹膜內(nei) 注射1.5×10 7 MET-1細胞到NOD / SCID小鼠中建立白血病模型。當這些小鼠的血清可溶性IL-2R- α （sIL- 2R- α ）水平超過1000pg / mL時，對這些小鼠進行治療實驗，這在腫瘤接種後約10至14天發生。

    大耐受劑量的定義(yi)

    在開始治療研究之前，在NOD / SCID小鼠中測定大耐受劑量的縮酚酸肽。每天通過腹膜內(nei) 施用每千克體(ti) 重0.125,0.25,0.5,1.0和2.0mg縮酚酸肽的劑量，持續2周。2.0mg / kg組中的所有小鼠在第7天死亡，並且1.0mg / kg組中80％的小鼠在第14天死亡。在0.5,2.25和0.125mg / kg組中的小鼠在注射縮酚肽後6個(ge) 月是stillalive 。因此，選擇用於(yu) 治療試驗的劑量為(wei) 0.5mg / kgevery14天，持續14天; 這與(yu) 其他研究人員在小鼠中使用的結果一致。

    Therapystudy

    在攜帶MET-1白血病的小鼠中進行治療性研究，在小腫瘤負荷試驗中血清替代腫瘤標誌物sIL-2R- α 值為(wei) 1000至10000μg / mL，在大腫瘤負荷試驗中為(wei) 10000至25000pg / mL 。在治療試驗中有5組。組1中，縮酚酸肽組，接收的0.5mg的縮酚酸肽/ kg體(ti) 重2 weeks.Group 2每隔一天，免疫治療（達珠單抗）基團，被賦予靜脈injectionsof腹腔注射100 μ 克達珠單抗在第0，7，14，組3，聯合治療組，接受縮酚酸和達利珠單抗的聯合治療（給藥方案如組1加組2）。第4組收到 200μ每周一次PBS，持續4周，並作為(wei) 對照。第5組，沒有腫瘤和沒有治療，作為(wei) NOD / SCID小鼠自然死亡的對照。在小腫瘤負荷治療試驗中每組有13隻小鼠（sIL- 2R - α ，1000-10 000 pg / mL），在大腫瘤負荷中每組有8隻小鼠（sIL-2R- α ，10 000- 25 000 pg / mL）。這些組被隨機分配並且在實驗開始時具有替代腫瘤標記物sIL-2R- α的可比較的平均水平。

    監測腫瘤生長

    的血清濃度國稅發可溶性IL-2R-的測量 α 或可溶性 β 2 -微球蛋白（ β 2 μ ）用酶聯免疫吸附測定進行。根據製造商的建議進行酶聯免疫吸附測定。

     

     

  • 不同實驗動物依據體表麵積的等效劑量轉換表（數據來源於FDA指南）

     

     

    動物 A (mg/kg) = 動物 B (mg/kg)×動物 B的Km係數/動物 A的Km係數

    		 

     

    例如，已知某工具藥用於(yu) 小鼠的劑量為(wei) 88 mg/kg , 則用於(yu) 大鼠的劑量換算方法：將88 mg/kg 乘以小鼠的Km係數（3），再除以大鼠的Km係數（6），得到該藥物用於(yu) 大鼠的等效劑量44 mg/kg。

 

 

  • 參考文獻

    [1] Ganguly，B。; Balasa，B。; Efros，L。; 公主Hinton; Hartman，S。; Thakur，A。; 熊，JM; 施密特，B。; 羅賓遜，RR; Sornasse，T。; Vexler，V。; Sheridan，JP，與(yu) Zenapax相比，CD25結合抗體(ti) Daclizumab High-Yield Process具有*的糖基化模式和降低的抗體(ti) 依賴性細胞介導的細胞毒性。MAbs 2016,8（7​​），1417-1424。
    [2] Chen，J。; 張，M。; Ju，W。; Waldmann，TA，使用縮酚肽及其與(yu) 針對CD25的未修飾的達珠單抗的組合有效治療成人T細胞白血病的鼠模型。Blood 2009,113（6），1287-93。

    分子式 分子量CAS號儲存方式
    -80 ℃長期儲存。幹冰運輸
    溶劑（常溫）DMSO水乙醇

    體(ti) 內(nei) 溶解度

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