orimabs技術領域

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重組蛋白製備
 

為(wei) 了產(chan) 生抗體(ti) ，一步是製備重組抗原蛋白。我們(men) 擁有用於(yu) 重組蛋白表達的三個(ge) 表達平台，包括哺乳動物細胞（CHO和HEK293無血清係統），酵母和大腸杆菌表達係統。

對於(yu) 人類抗原，哺乳動物表達係統是理想的表達係統，因為(wei) 其重折疊和翻譯後修飾（例如糖基化）接近天然抗原。在大多數情況下，細胞表麵抗原的細胞外結構域（例如腫瘤標誌物）是抗體(ti) 生成的目標域。需要製備細胞外結構域的重組蛋白，而不是完整的表麵蛋白（包括單個(ge) 或多個(ge) 跨膜和細胞內(nei) 結構域）。然而，部分地由於(yu) 其天然易位方式的改變而僅(jin) 表達天然蛋白的一部分是非常具有挑戰性的。為(wei) 了克服這個(ge) 問題，我們(men) 開發了幾種新穎的哺乳動物表達載體(ti) ，它們(men) 能夠使這種困難表達蛋白高水平表達。
 

抗原高表達細胞係的建立
 

有時為(wei) 了確保用於(yu) 文庫篩選的抗原處於(yu) 其天然構象，我們(men) 使用抗原陰性和陽性細胞係來篩選文庫。我們(men) 有一個(ge) 慢病毒表達係統來創建抗原高表達細胞係。抗原的高表達與(yu) 細胞內(nei) EGFP的表達有關(guan) ，因此可以通過熒光激活細胞分選術（FACS）純化高表達的細胞。

酵母菌展示

酵母展示是一種用於(yu) 抗體(ti) 發現的新開發技術。與(yu) 噬菌體(ti) 展示相比，酵母展示具有以下優(you) 勢：真核表達，利用FACS分選來選擇性分離不同親(qin) 和水平群體(ti) 的能力以及方便地通過FACS檢測抗原結合，這使得酵母展示成為(wei) 發現新抗體(ti) 的有力工具。

然而，很大程度上由於(yu) 酵母轉化效率低而構建大的酵母展示抗體(ti) 文庫是非常具有挑戰性的。我們(men) 開發了一種技術，可使酵母轉化效率比傳(chuan) 統方法提高1000倍，從(cong) 而有可能有效地構建大型酵母展示抗體(ti) 庫。

除了優(you) 化酵母轉化效率外，我們(men) 還開發了新穎的酵母展示載體(ti) ，可以在單體(ti) 或二聚體(ti) 中展示scFv，具有*的標簽和接頭，可有效克隆，展示，檢測和保護scFv的結構和功能不受影響由共表達的AGA2蛋白和標簽組成（圖1）。 

如果將分離的scFv的終目標工程化為(wei) 二聚體(ti) ，例如scFv-Fv或完整抗體(ti) ，則建議使用二聚體(ti) scFv庫，因為(wei) 高親(qin) 和力單體(ti) scFv可能不會(hui) 轉化為(wei) 高親(qin) 和力的二聚體(ti) 。如果scFv是終的抗體(ti) 形式，例如標記納米顆粒或開發基於(yu) scFv的成像探針，則建議將單體(ti) scFv顯示庫用於(yu) scFv分離。有時抗原隻有很小的口袋抗原決(jue) 定簇，這很可能在小肽抗原中觀察到，全尺寸的scFv太大而無法適合小的口袋抗原決(jue) 定簇，一個(ge) 僅(jin) 包含VH或VL的單結構域文庫將是理想的屏幕。

我們(men) 還開發了一種使用重組蛋白，標簽融合蛋白或基於(yu) 細胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。從(cong) 文庫分離的scFv親(qin) 和力通常在單體(ti) 的納摩爾範圍內(nei) ，並且當被工程化以進行調光時，例如scFv-Fc或完整抗體(ti) ，親(qin) 和力通常將增加約10倍。
 

插圖1：酵母顯示的二聚體(ti) 和單體(ti) scFv。

圖1：基於(yu) 細胞的酵母展示抗體(ti) 文庫淘選。

噬菌體展示

酵母展示對於(yu) Fab文庫的構建是具有挑戰性的，因為(wei) 很難以適當的比率同時表達VH和VL / VK兩(liang) 者以使VH和VL / VK之間100％偶聯。因此，我們(men) 的Fab文庫是使用噬菌體(ti) 展示構建的。OriMAbs已開發出用於(yu) Fab庫構建的噬菌體(ti) 展示係統。兩(liang) 組噬菌粒，pDCK1和pDCK1.1；以及pDCL1和pDCL1.1分別設計用於(yu) κ和λ鏈Fab展示。兩(liang) 種載體(ti) 均具有IgG1 CH1恒定區，並且所有恒定區均已針對大腸杆菌進行了密碼子優(you) 化。表達和所有酶被設計為(wei) 方便消化和有效克隆。噬菌粒pDCK1和pDCL1也可以用於(yu) scFv展示，其中，接頭中的酶位點也被優(you) 化以確保翻譯的接頭對於(yu) VH和VL之間的有效偶聯是靈活的。

酵母展示人類天真的調光器-scFv庫

使用*的技術和新穎的展示載體(ti) pYDS2（展示調節劑scFvs），OriMAbs從(cong) B淋巴細胞中分離出了1x1011酵母展示調節劑scFv庫，該B淋巴細胞來自於(yu) 56例健康供體(ti) 的5升外周血。總共分離出6.9 mg總RNA，並從(cong) 中純化了125.3 mg mRNA，並使用能夠挽救所有人類抗體(ti) 庫的新型引物用於(yu) 逆轉錄和VH，VK和VL擴增。ScFv在釀酒酵母上以較暗的方式顯示EBY100通過AGA1和AGA2之間的相互作用使細胞表麵應變。在測序的24個(ge) 克隆中，所有克隆均包含scFv基因，其中83.3％具有單個(ge) scFv基因，16.7％具有2個(ge) scFv基因。Flag標簽在100％克隆中表達，而V5標簽在83.3％（20/24）克隆中表達（圖2）。V5標簽表達失敗是由於(yu) scFv基因發生移碼突變，可能是種係中編碼截短抗體(ti) 或PCR引入的真實序列（3/24）或構象障礙（1/24）。通過磁選和流選與(yu) 該文庫隔離（圖3）。建議將該庫用於(yu) scFv發現，以便將scFv工程化為(wei) 二聚體(ti) ，例如scFv-Fc或完整抗體(ti) 。
 

圖2：在24個(ge) 酵母克隆中的V5表達顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍色：V5標簽表達

圖3：在24個(ge) 酵母克隆中的標誌表達顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍色：標誌標記表達

酵母展示人類天真單體-scFv庫

還使用不同的酵母展示載體(ti) pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構建了酵母展示的人類天然單體(ti) scFv庫，用於(yu) 二聚體(ti) -scFv庫的構建。庫大小為(wei) 1.2×10 ^ 11。建議將該庫用於(yu) scFv發現，因為(wei) scFv將是應用程序的終格式。

酵母展示人類天真的單域庫

還使用酵母展示載體(ti) pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構建了酵母展示人類樸素單域文庫，用於(yu) 單體(ti) 或二聚體(ti) -scFv文庫的構建。庫大小為(wei) 5×10 ^ 9。推薦該文庫用於(yu) 發現隻有小口袋表位的抗原的單域抗體(ti) 。
 

噬菌體展示人類天然Fab庫

我們(men) 使用分離自56個(ge) 健康供體(ti) 的相同5 L外周血的VH和VL池，使用載體(ti) pDCK和pDCL（kappa：lambda = 2：1）構建了2×1010 Fab噬菌體(ti) 展示文庫。評估的12個(ge) 克隆顯示100％VK / VL插入和91.6％（11/12）VH插入。
 

從酵母展示文庫中發現抗體

我們(men) 還開發了一種使用重組蛋白，標簽融合蛋白或基於(yu) 細胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。庫平移包括2-3輪磁選，然後是2-3輪精細流選。排序的高親(qin) 和力酵母展示群體(ti) 可直接使用流式細胞儀(yi) 進行個(ge) 體(ti) 克隆鑒定，或轉化為(wei) 分泌型scFv亞(ya) 庫，並使用高通量ELISA進行個(ge) 體(ti) 克隆鑒定。鑒定出的scFv將被表達和純化以用於(yu) 表征，例如親(qin) 和力測量和插入分析，然後進入下遊工程流程。從(cong) 文庫中分離出的scFv親(qin) 和力在單體(ti) 中通常處於(yu) 納摩爾範圍內(nei) （圖4），通常在經過調光後，親(qin) 和力會(hui) 增加約10倍，
 

圖4：樣品scFvs a和b的親(qin) 和力測量。

通過噬菌體庫淘選抗體

我們(men) 已經開發了固相和液相的噬菌體(ti) 展示文庫淘選。直接在固相（例如ELISA板或免疫管）上的抗原包被可能會(hui) 使抗原構象變形，結果可能丟(diu) 失一些表位，從(cong) 而降低分離的抗體(ti) 的多樣性，或者分離的抗體(ti) 可能根本不結合天然構象抗原。為(wei) 了克服這個(ge) 潛在的問題，我們(men) 已經開發液相淘選法，其中，無論是抗原和抗體(ti) 在其天然構象。抗原結合的噬菌體(ti) 群體(ti) 將通過磁選分離，分離的可溶性Fab抗體(ti) 將在大腸杆菌中產(chan) 生。
 

抗體工程

從(cong) 抗體(ti) 庫中分離的單結構域抗體(ti) ，scFv或Fab抗體(ti) 通常需要進行工程改造以用於(yu) 不同的目的，例如，可以將它們(men) 改造為(wei) scFv-Fc或全抗體(ti) ，以實現更高的親(qin) 和力，更好的穩定性和更長的循環時間。我們(men) 提供所有已知格式的抗體(ti) 的設計和工程改造，例如scFv，二聚體(ti) scFv，Fab，F（ab'）2，單結構域抗體(ti) ，scFv-Fc和全抗體(ti) 。

親和力成熟

通常，從(cong) 我們(men) 的文庫中分離出的抗體(ti) 具有納摩爾範圍的親(qin) 和力，當工程化為(wei) 二聚體(ti) 時，親(qin) 和力將增加約10倍。因此，從(cong) 我們(men) 的文庫生成的抗體(ti) 通常不需要親(qin) 和力成熟。如果需要更高的親(qin) 和力，我們(men) 可以選擇通過酵母和噬菌體(ti) 展示技術進行親(qin) 和力成熟。

酵母展示的優(you) 勢在於(yu) ，可以使用熒光輔助細胞分選術（FACS）輕鬆對抗原結合的酵母菌群進行分選，因為(wei) 酵母菌的大小足以被FACS識別。這使酵母菌的展示比噬菌體(ti) 在親(qin) 和力成熟方麵更有效，因為(wei) 除了用於(yu) 噬菌體(ti) 展示的抗原濃度管理和嚴(yan) 格洗滌之外，FACS在直接將高親(qin) 和力酵母種群從(cong) 其他培養(yang) 基轉化為(wei) 高親(qin) 和力酵母菌方麵更有效（圖xx） 。

圖5：用於(yu) 抗原結合的高親(qin) 和力酵母群體(ti) 的流式分選。

抗體生產

我們(men) 已經開發了用於(yu) 抗體(ti) 表達的表達係統，包括用於(yu) 以細胞內(nei) 或分泌形式表達單結構域抗體(ti) ，scFv和Fab的大腸杆菌係統；用於(yu) 單結構域抗體(ti) ，scFv和Fab分泌表達的酵母係統; 和用於(yu) 所有片段抗體(ti) 和全抗體(ti) 的分泌表達的哺乳動物係統。我們(men) 提供通過這些表達係統生產(chan) 和純化所有抗體(ti) 形式的服務。
 

抗體藥物偶聯物

抗體(ti) 藥物偶聯物（ADC）是一種新興(xing) 的抗體(ti) 治療技術。抗體(ti) （通常是全抗體(ti) ）通過可裂解或不可裂解的連接子用超毒性藥物（例如MMAE，MMAF和DM1）標記，以特異性地向抗原陽性細胞傳(chuan) 遞毒性。死細胞釋放的毒素（MMAE和DM1）也可以通過旁通機製進入並殺死附近的抗原陽性細胞。我們(men) 提供與(yu) 這些藥物結合的完整抗體(ti) 和相關(guan) 特性的服務。 
 

雙特異性抗體

雙特異性抗體(ti) （一個(ge) 臂使用抗CD3抗體(ti) 靶向T細胞，另一臂使用腫瘤特異性抗體(ti) 靶向腫瘤細胞）充當將T細胞和腫瘤細胞結合在一起並激活T細胞殺死腫瘤的橋梁。我們(men) 提供設計，構建，表達和評估雙特異性抗體(ti) 的服務。

光學成像的抗體標記

光學成像是一種用於(yu) 體(ti) 內(nei) 抗體(ti) 生物分布研究的方便且有用的方法，例如小鼠中的抗原表達譜研究，小鼠模型中的腫瘤靶向評估。由於(yu) 近紅外（NIR）染料在組織中的深度滲透（大約1 cm），因此常用於(yu) 這些研究。我們(men) 提供與(yu) 這些染料和相關(guan) 表征有效結合和純化片段抗體(ti) 或完整抗體(ti) 的服務。