DIAGNOVITAL®2019-NCOV

 rtalabs DIAGNOVITAL®2019-NCOV

使用說明
1） 預期用途
本文介紹了實時RT-PCR檢測在體(ti) 外定性檢測中的應用
2019年呼吸道標本和血清中的新型冠狀病毒（2019 nCoV）。2019 nCoV引物和探針組設計用於(yu) 2019 nCoV的特定檢測。
這些試劑盒遵循疾控中心和世衛組織的新檢測指南。
2） DIAGNOVITAL®檢測
DIAGNOVITAL®2019-NCOV是基於(yu) RT-PCR的2019武漢冠狀病毒（2019-NCOV）實時檢測係統。2019年nCoV被認為(wei) 是一種新的人類冠狀病毒，與(yu) 引起季節性急性呼吸係統疾病的常見人類冠狀病毒（229E，NL63，OC43，HKU1）有著明顯的遺傳(chuan) 差異。它在基因上也不同於(yu) 兩(liang) 個(ge) 新人類
冠狀病毒、MERS-CoV和SARS-CoV。

DIAGNOVITAL®2019-NCOV檢測到2019年NCOV存在3個(ge) 不同且高度特異的基因序列：E基因、N基因和RdRP基因。所有3項化驗必須檢測為(wei) 陽性，以確認樣本為(wei) 2019 nCoV陽性。
此外，還包括非感染性陽性對照和陰性人類提取對照。陽性對照用於(yu) 確認分析的功能和總體(ti) PCR性能，陰性人類提取對照用於(yu) 評估獨立於(yu) 2019年nCoV分析的RNA分離質量。

2.1）基於(yu) QPCR的2019-NCOV檢測
檢測2019株nCoV的一步是將病毒RNA轉化為(wei) c。之後，通過熒光標記探針，對2019年nCoV*的目標序列進行實時放大監測：當加入新擴增的鏈時，熒光團（FAM™) 被釋放，可以觀察到熒光信號的增加。
由於(yu) 冠狀病毒的固有突變率，目標序列中的突變有可能隨著時間的推移而發生和積累。這可能導致基於(yu) PCR的檢測方法出現假陰性結果。DIAGNOVITAL®2019-NCOV通過對3個(ge) 不同的目標序列使用3種檢測分析來解決(jue) 此問題，以大限度地減少由改變的目標序列導致假陰性結果的機會(hui) 。
如果樣品在一個(ge) 或多個(ge) 分析中檢測為(wei) 陰性，則可能需要額外的補充檢測。2019年nCoV的原始靶序列作為(wei) 非感染性靶陽性對照（TPC）包括在內(nei) ，以檢查檢測分析的完整性。
應始終通過補充方法和獨立實驗室中的附加分析來確認檢測呈陽性的樣品。

PRODUCT SIZE SKU

DIAGNOVITAL®2019-NCOV

50 rxn / 20 µl PCC

SKU15259

2.2) MATERIALS PROVIDED

QUANTITY AND VOLUME COMPONENT

2.3）所需附加材料
•核酸提取的適當方法和設備（見第3.4章）
•為(wei) FAM配備實時PCR檢測係統™ 偵(zhen) 查
•可調移液管和安裝過濾移液管頭
•適當的PSA和工作區，用於(yu) 處理潛在感染性樣本
•表麵去汙劑，如Zap™ （生命科技），遠離™ （費舍爾科學），離開™ （Fisher Scientific），10%漂白劑（市售5.25-6.0%次氯酸鈉的1:10稀釋度）
•無核酸酶管/條/板，用於(yu) 製備稀釋液、主混合物等；與(yu) PCR裝置相對應的無核酸酶管/條/板
•試劑和樣品的適當儲(chu) 存選擇（4℃、-20℃、-70℃）

2.4）儲(chu) 存
•將所有部件儲(chu) 存在-20°C下，避免重複凍融循環。•保護2X qPCR主混合料不受光照，因為(wei) 長時間曝光會(hui) 降低熒光粉的性能。

3） 開始前的注意事項
3.1）生物安全•穿戴適當的個(ge) 人防護裝備（如長袍、無粉手套，
當使用臨(lin) 床樣本時。•應按照生物安全2級或更高級別的指南，在經認證的二級生物安全櫃中進行樣本處理。

3.2）試樣
僅(jin) 使用適當的樣本進行測試，例如：•呼吸樣本，包括鼻咽/口咽抽吸物或衝(chong) 洗液、鼻咽/口咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物和痰。•拭子樣本隻能在帶有合成的拭子上采集（例如
聚酯或滌綸（帶鋁或塑料軸）。不接受含有海藻酸鈣的棉簽或帶有木軸的棉簽
3.3）試樣-搬運和儲(chu) 存
•采集後，樣品可在4°C下保存72小時。
•如果預計提取會(hui) 延遲，則將樣品儲(chu) 存在-70°C或更低的溫度下。
•提取的核酸應儲(chu) 存在-70°C或更低的溫度下。
如果
•未將其保存在2-4°C（≤4天）或在-70°C或更低溫度下冷凍。
•標簽不足或缺乏文件。
•它們(men) 不適用於(yu) 此目的（有關(guan) 合適的樣品材料，見上文）。
•樣本容量不足。

3.4）樣品製備/核酸提取：RT-PCR檢測的性能很大程度上取決(jue) 於(yu) 樣品模板RNA的量和質量。強烈建議在測試樣本之前，對回收和純度的RNA提取程序進行鑒定和驗證。•與(yu) DIAGNOVITAL®檢測試劑盒成功結合使用的合適核酸提取係統包括：bioMérieux NucliSens®係統、QIAamp®病毒RNA小試劑盒、QIAamp®Minelote病毒自旋試劑盒或RNeasy®小試劑盒（QIAGEN）、EZ1 DSP病毒試劑盒（QIAGEN）、Roche MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒、Roche MagNA Pure
緊湊型核酸分離試劑盒、羅氏麥格納純96 和病毒核酸小容量試劑盒、Invitrogen ChargeSwitch®總RNA細胞試劑盒。
•將剩餘(yu) 樣本和提取的核酸保存在-70°C下。•僅(jin) 解凍一天內(nei) 要測試的樣本提取物數量。

•測試前不要冷凍/解凍提取物超過一次，因為(wei) 每次冷凍/解凍循環都會(hui) 降低RNA質量。•根據樣本類型，可以直接使用患者樣本。
然而，這可能需要預先的溶解步驟和滴定樣品上的量，可以在不抑製反應的情況下使用。此過程尚未驗證，請使用
建議分離RNA。
3.5）反應裝置
1） 在開始實驗之前，確保所有必要的設備和裝置都是合適的、校準的和功能正常的。
2） 對設備和工作區進行淨化，並準備好以下實驗所需的一切，以保持工作流程的簡短和可重複性。
3） 打開PCR檢測係統並對其進行編程，以避免在設置反應後出現延遲。
4） 在冰上解凍DIAGNOVITAL®2019-NCOV的所有成分，並輕輕但*地混合，以確保成分均勻分布。快速旋轉收集管底部的液體(ti) 。
5） 對於(yu) 一個(ge) 測試，準備一係列的RNA稀釋來確定理想的濃度窗口。建議的樣品體(ti) 積小於(yu) 終反應體(ti) 積的10%。
6） 設置Mastermix板：

a、 務*無核酸酶的二氧化二氫（dH2O）代替樣品材料（NTC）製備對照反應，以檢測試劑中的汙染。
b、 始終包括陰性人類提取控製（HEC）的分析，以評估您的RNA分離物的質量。
c、 當使用提供的靶陽性對照品（TPC）時，使用1微升/反應，並將無核酸酶的dH2O添加到20微升。
d、 強烈推薦2份以上的複製品/樣品。
e、 為(wei) 所有計劃的反應準備足夠的混料。建議為(wei) 2個(ge) 附加反應製備mastermix，以補償(chang) 移液誤差。
f、 將混合料分發到板條/盤子中。示例設置如圖1所示。

OMPONENT VOLUME

50X DIAGNOVITAL®Reverse Transcriptase 0.4 µl

DIAGNOVITAL®2X qPCR Mastermix (E / N / RdRP / HEC) 10 µl

isolated sample RNA / TPC X µl / 1 µl

Nuclease-free dH2O to 20 µl

7） 將Mastermix板轉移到單獨的工作區以添加樣品材料。
在單獨的工作區準備試劑和終反應裝置有助於(yu) 避免設備和試劑與(yu) 樣品材料的汙染。
a、 在處理陽性樣品之前，先準備好陰性反應並密封。建議在製備和密封NTC後，僅(jin) 將潛在陽性樣品材料和包含的目標陽性對照品帶到工作區。
b、 將您的樣品添加到Mastermix板中。示例設置如圖2所示。