k-assay大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

用於(yu) 定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yang) 中的大鼠 CKMB上清液和其他生物液體(ti) 。

kamiya目錄號編號KT-12247

僅(jin) 供研究使用。

產(chan) 品信息

大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

 目錄號編號KT-12247

 預期用途

試劑盒是一種夾心酶免疫測定法，用於(yu) 體(ti) 外定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yang) 上清液和其他生物體(ti) 液中的大鼠 CKMB。僅(jin) 供研究使用。

 組件

需要但未提供的材料

1. 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標儀(yi) 。

2. 具有高精度和一次性槍頭的單道或多道移液器。

3. 微量離心管。

4. 去離子水或蒸餾水。

5. 吸水紙吸幹微孔板。

6. 清洗液容器。

7. 0.01 mol/L（或 1x）磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水 (PBS)，pH 7.0-7.2。

 儲(chu) 存

所有試劑均應按照小瓶上的標簽保存。校準品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條接收後應在-20 ℃ 下儲(chu) 存，其他板條應在 4 ℃ 下儲(chu) 存。未使用的板條應保存在密封袋中，並提供幹燥劑，以盡量減少暴露於(yu) 潮濕空氣。開封的檢測試劑盒將在 1 個(ge) 月內(nei) 保持穩定，前提是按照上述方法儲(chu) 存。

測試原理

本試劑盒中提供的微孔板已用 CKMB 特異性抗體(ti) 預包被。然後用 CKMB 特異性生物素結合抗體(ti) 將校準品或樣本加入適當的微孔板孔中。然後，將偶聯辣根過氧化物酶 (HRP) 的抗生物素蛋白加入到每個(ge) 微孔板小孔中並孵育。加入 TMB 底物溶液後，僅(jin) 含 CKMB、生物素結合抗體(ti) 和酶結合抗生物素蛋白的微孔顯示顏色變化。酶-底物反應終止  by  的  添加  of  硫酸的  酸  溶液  和  的  顏色  變更  is  采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定。然後通過比較樣本的 O.D. 與(yu) 校準曲線，測定樣本中 CKMB 的濃度。

 樣本采集和儲(chu) 存

血清

使用血清分離管，使樣本在室溫下凝結 2 小時或在 4 °C 下過夜，然後以約 1,000 xg 離心 20 min。立即測定新鮮製備的血清或將等份樣本儲(chu) 存在-20 °C 或-80 °C 下備用。避免反複凍融循環。

血漿

使用 EDTA 或肝素作為(wei) 抗凝劑采集血漿。采集後 30 min 內(nei) ，在 4 ℃ 下以 1,000 xg 離心樣本 15 min。立即取出血漿並測定，或將等分樣本儲(chu) 存在-20 °C 或-80 °C 備用。避免反複凍融循環。

組織勻漿

組織勻漿的製備因組織類型而異。

1. 在冰冷 PBS 中衝(chong) 洗組織，*除去過量血液，並在勻漿前稱重。

2. 將組織切成小塊，並在冰上用玻璃勻漿器（Micro tissue Grinders works，也是如此）在新鮮裂解緩衝(chong) 液（需要根據目標蛋白的亞(ya) 細胞位置選擇不同的裂解緩衝(chong) 液）（w:v = 1:20-1:50，例如在 20-50 mg 組織樣本中加入 1 mL 裂解緩衝(chong) 液）中勻漿化。

3. 用超聲細胞破碎儀(yi) 對所得混懸液進行超聲處理，直至溶液澄清。

4. 然後，勻漿以 10,000×g 離心 5 min。立即收集上清液並進行測定，或等分並在≤-20 ℃ 下儲(chu) 存。

細胞裂解物

根據以下說明進行測定前，需要裂解細胞。

1. 貼壁細胞應用冷 PBS 輕輕洗滌，然後用胰蛋白酶分離，1 000 xg 離心 5 min 收集（懸浮細胞可直接離心收集）。

2. 在冷 PBS 中清洗細胞三次。

3. 在濃度為(wei)  10 的新鮮裂解緩衝(chong) 液中重懸細胞⁷ 細胞/mL。 If it is 必要， 的 細胞 可能是 接受 to 超聲處理 至 的 溶液 is 澄清。

4. 在 4 °C 下以 1,500 xg 離心 10 min，除去細胞碎片。立即測定或等分並在≤-20 ℃ 下儲(chu) 存。

細胞培養上清液和其他生物體液

以 1,000 xg 離心樣品 20 min，立即收集上清液並進行測定，或將等份樣品儲(chu) 存在-20 °C 或-80 °C 備用。避免反複凍融循環。

 注：

1. 5 天內(nei) 使用的樣品可在 4<unk>C 下儲(chu) 存，否則樣品必須在-20<unk>C（≤1 個(ge) 月）或-80<unk>C（≤2 個(ge) 月）下儲(chu) 存，以避免失去生物活性和汙染。

2. 進行試驗時，將樣品恢複至室溫。

3. 樣本溶血會(hui) 影響結果，因此不應使用溶血標本。

4. 根據我們(men) 內(nei) 部數據量，強烈建議使用血清代替血漿進行檢測。

試劑製備

使用前，將所有試劑盒組分和樣本恢複至室溫 (18-25 ℃)。如果試劑盒不能一次性用完，請隻取出試紙條和試劑進行現實驗，剩餘(yu) 試紙條和試劑留作所需條件。

校準品

用 1.0 mL 校準品稀釋液複溶校準品，室溫下放置 10 min，輕輕振搖（不得起泡）。儲(chu) 備液中校準品的濃度為(wei) 200 ng/mL。請先將原液稀釋至 100 ng/mL，稀釋後的校準品作為(wei) 高濃度校準品 (100 ng/mL)。然後準備 7 個(ge) 含有 0.5 mL 校準品稀釋液的試管，根據下圖，使用經稀釋的校準品製備雙倍稀釋係列。在下一次轉移前，充分混勻各試管。設置 7 個(ge) 稀釋校準品點，例如 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL，後一個(ge) 含有校準品稀釋液的 EP 管為(wei) 空白，濃度為(wei) 0 ng/mL。

檢測試劑 A 和檢測試劑 B

使用前短暫離心或離心儲(chu) 備液檢測 A 和檢測 B。分別用試驗稀釋劑 A 和 B 將其稀釋至 100 倍工作濃度。

清洗液

用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 濃縮液 (30X)，製備 600 mL 清洗液 (1X)。

TMB 底物

用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液，不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。

注：

1. 在測定前 15 min 內(nei) 製備校準品。請勿在 37 ℃ 下溶解試劑°C 直接。

2. 不允許在微孔中直接進行連續稀釋。

3. 請按照說明仔細複溶校準品或工作檢測試劑 A 和 B，避免起泡並輕輕混合，直至晶體(ti) *溶解。為(wei) 盡量減少移液造成的不精密度，使用小體(ti) 積並確保移液器經過校準。建議一次移液抽吸 10 μL 以上。

4. 重組校準品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 隻能使用一次。

5. 如果在清洗濃縮液 (30X) 中形成晶體(ti) ，則加熱至室溫並輕輕混合，直至晶體(ti) *溶解。

6. 汙染的水或試劑配製容器會(hui) 影響檢測結果。

樣品製備

1. 我們(men) 僅(jin) 對試劑盒本身負責，而不對測定過程中消耗的樣本負責。用戶應計算整個(ge) 檢測中可能使用的樣本量。請提前預留足夠的樣本。

2. 請在測定前預測濃度。如果這些值不在校準曲線範圍內(nei) ，則用戶必須確定其特定實驗的宜樣本稀釋度。應使用 PBS 稀釋樣本。

3. 如果手冊(ce) 中未指明樣本，則有必要進行初步實驗以確定試劑盒的有效性。

4. 通過化學裂解緩衝(chong) 液製備的組織或細胞提取樣本，由於(yu) 某些化學物質的影響，可能會(hui) 導致意外的 ELISA 結果。

5. 由於(yu) 其他來源的抗原和我們(men) 試劑盒中使用的抗體(ti) 之間可能存在錯配（例如，抗體(ti) 靶向構象表位而不是線性表位），一些來自其他生產(chan) 商的天然或重組蛋白可能無法被我們(men) 的產(chan) 品識別。

6. 受細胞活力、細胞數量或取樣時間等因素影響，試劑盒可能無法對細胞培養(yang) 上清液樣本進行檢測。

7. 建議使用未經長期儲(chu) 存的新鮮樣本進行試驗。否則，這些樣品可能發生蛋白質降解和變性，終導致錯誤結果。

分析方法

1. 測定稀釋校準品、空白和樣品的微孔。校準品製備 7 孔，空白製備 1 孔。向適當的孔中分別加入 100µL 校準品稀釋液（讀取試劑製備）、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

2. 清除各孔中的液體(ti) ，不要清洗。

3. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，並在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

4. 吸取該溶液，並使用噴霧瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動洗滌器用 350µL 1X 清洗液清洗每個(ge) 孔，並靜置 1-2 min。通過將微孔板卡在吸水紙上，*去除所有微孔中的剩餘(yu) 液體(ti) 。總共清洗 3 次。後一次洗滌後，通過抽吸或傾(qing) 倒除去任何剩餘(yu) 的洗滌緩衝(chong) 液。倒置平板，在吸水紙上吸幹。

5. 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作液，用封板覆膜覆蓋孔，並在 37 ℃ 下孵育 30 min。

6. 按照步驟 4 重複抽吸/清洗過程共 5 次。

7. 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 10-20 min（不得超過 30 min）。避光保存。加入底物溶液後液體(ti) 將變藍。

8. 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液後，液體(ti) 將變黃。輕敲微孔板側(ce) 麵，混合液體(ti) 。如果顏色變化不均勻，輕輕敲擊平板以確保充分混合。

9. 取下平板底部的水滴和指紋，確認液體(ti) 表麵無氣泡。然後運行酶標儀(yi) ，立即在 450 nm 處測定。

注：

1. 試驗準備：每次實驗保留適當數量的孔，並從(cong) 微孔板中取出額外的孔。其餘(yu) 孔應重新密封並儲(chu) 存在-20 ℃ 下。

2. 樣本或試劑添加：請使用新鮮製備的校準品。請小心地向孔中加入樣品並輕輕混合以避免起泡。請勿觸摸孔壁。對於(yu) 程序中的每個(ge) 步驟，向測定板中加入試劑或樣品的總分配時間不應超過 10 min。這將確保每個(ge) 移液步驟的運行時間相等，不會(hui) 中斷。建議重複檢測所有校準品和樣本，盡管不是必需的。為(wei) 避免交叉汙染，在添加校準品、樣本和試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲(chu) 液器。

3. 孵育：為(wei) 確保結果準確，孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜。在孵育步驟之間，不得使孔長時間處於(yu) 未覆蓋狀態。試劑加入微孔板條後，在測定過程中的任何時間都不要讓板條變幹。必須控製孵育時間和溫度。

4. 清洗：清洗程序至關(guan) 重要。在每個(ge) 步驟中*去除液體(ti) 對於(yu) 良好性能至關(guan) 重要。後一次洗滌後，通過抽吸或傾(qing) 倒除去任何剩餘(yu) 的清洗液，並除去平板底部的任何水滴和指紋。清洗不充分將導致精密度較差和吸光度讀數假性升高。

5. 反應時間的控製：觀察加入 TMB 底物後顏色的變化（如每 10 min 觀察一次），如顏色過深，應提前加入終止液，避免反應過強，導致吸光度讀數不準確。

6. TMB 底物容易被汙染。請避光保存。

7. 低於(yu)  60% 的環境濕度可能會(hui) 對終性能產(chan) 生一些影響，因此，建議在該條件下使用加濕器。

結果計算

計算每個(ge) 校準品、質控品和樣本的重複兩(liang) 次讀數的平均值，並減去平均零校準品光密度。通過繪製每份校準品的平均 od 值和濃度，構建校準曲線，並通過該曲線圖上的點繪製適合擬合曲線，或在對數-對數曲線圖紙上以 CKMB 濃度為(wei) y 軸，以吸光度為(wei) x 軸，創建校準曲線。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋，則從(cong) 校準曲線讀取的濃度必須乘以稀釋因子。

性能

檢測範圍

1.56–100 ng/mL。

用於(yu)  ELISA 的校準曲線濃度為(wei) 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL。

 靈敏度

CKMB 的小可檢測劑量通常低於(yu) 0.67 ng/mL。

該試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義(yi) 為(wei) 可與(yu) 零區分的低蛋白濃度。通過將 20 次零校準品重複測定的平均光密度值加上兩(liang) 個(ge) 標準差並計算相應的濃度來確定。

專屬性

該方法檢測 CKMB 具有較高的靈敏度和*的特異性。

分析方法總結

1. 準備好所有試劑、樣本和校準品；

2. 向各微孔中加入 100 μL 校準品或樣本。37 °C 下孵育 1 小時；

3. 吸出並加入 100 μL 製備的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時；

4. 抽吸並清洗 3 次；

5. 加入 100 μL 製備好的檢測試劑 B，37 °C 孵育 30 min；

6. 抽吸並清洗 5 次；

7. 加入 90 μL 底物溶液。37 °C 下孵育 10-20 min；

8. 加入 50 μL 終止液。立即在 450 nm 處讀數。

重要說明

1. 終實驗結果將與(yu) 產(chan) 品的有效性密切相關(guan) ，因此試劑盒應在失效日期前使用。請嚴(yan) 格按照說明儲(chu) 存試劑盒。

2. 不同批次試劑盒的檢測範圍、靈敏度和顯色時間可能略有不同。請嚴(yan) 格按照試劑盒隨附說明書(shu) 進行實驗，本公司網站電子版僅(jin) 供參考。

3. 請勿將不同批次試劑盒中的試劑混合或替代。僅(jin) 使用製造商提供的試劑。

4. 儲(chu) 存和孵育期間，所有試劑均應避免強光照射。所有試劑瓶蓋均應蓋緊，防止微生物的蒸發和汙染。TMB 底物應保持無色，直至與(yu) 結合微孔板的酶反應。

5. 首次開板時孔內(nei) 可能有一些霧狀物質。對終試驗結果無任何影響。在需要之前，請勿從(cong) 儲(chu) 存袋中取出微孔板。

6. 試劑製備和加載過程中的錯誤操作，以及酶標儀(yi) 參數設置不正確可能導致結果不正確。帶寬為(wei)  10 nm 或更低，在 450±10 nm 波長下光密度範圍為(wei) 0-3 O.D. 的酶標儀(yi) 可用於(yu) 吸光度測量。實驗前請仔細閱讀說明書(shu) 並調整儀(yi) 器。

7. 樣品製備和實驗操作的每個(ge) 步驟的變化可能導致不同的結果。為(wei) 了獲得更好的重現性結果，應控製試驗中每個(ge) 步驟的操作。

8. 每個(ge) 套件均已嚴(yan) 格通過 Q.C 測試。然而，由於(yu) 一些非預期運輸條件或不同的實驗室設備，終端用戶的結果可能與(yu) 我們(men) 的內(nei) 部數據不一致。不同批次試劑盒之間的試驗內(nei) 差異也可能由上述因素引起。

9. 來自不同製造商的具有相同項目的套件可能產(chan) 生不同的結果，因為(wei) 我們(men) 尚未將我們(men) 的產(chan) 品與(yu) 其他製造商進行比較。

10. 用於(yu) 抗體(ti) 製備的試劑盒校準品和免疫原通常為(wei) 重組蛋白，由於(yu) 重組蛋白製備中可能會(hui) 用到不同的片段、表達係統、純化方法等，我們(men) 無法保證試劑盒能夠檢測到其他公司的重組蛋白。所以，不建議使用試劑盒進行重組蛋白的檢測。

11. 請預測樣本中目標分子的濃度，或者安排預實驗，是解決(jue) 具體(ti) 問題的好方法，例如樣本的濃度超出試劑盒的檢測範圍。

12. 由於(yu) 其有效性的不確定性，該試劑盒可能不適用於(yu) 檢測一些特殊實驗的樣本，例如基因敲除實驗。

13. 建議與(yu) 該試劑盒一起使用的終止液是一種酸性溶液。使用本材料時，請佩戴眼睛、手、麵部和防護服。

僅(jin) 供研究使用。

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