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phiphilux泛毒素

　更新時間：2020-03-27　點擊量：1033

 

 

phiphilux泛毒素

概述

泛毒素™ 是 OncoImmunin,Inc. 新的基於(yu) 活細胞的試劑盒，用於(yu) 測量細胞毒性淋巴細胞打擊的致死物成功遞送到單個(ge) 靶細胞。該試劑盒用於(yu) 具有雙激光（488 和 633 nm）細胞計數能力的 80 次測定。（對於(yu) 單激光係統，請聯係 OncoImmunin,Inc.直接。）

 

泛毒素™ 與(yu) 格蘭(lan) 毒素®加！和CyToxiLux®加！、OncoImmunin,Inc. 的其他單細胞毒性檢測試劑盒，區別在於(yu) 細胞滲透性、熒光底物：泛毒素™ 含有可檢測兩(liang) 者顆粒酶 B 和上遊半胱天冬酶活性，而底物在格蘭(lan) 毒素® 旨在僅(jin) 檢測顆粒酶 B 活性，並在CyToxiLux® 下遊半胱天冬酶活性。與(yu) 其他兩(liang) 個(ge) 套件一樣，泛毒素™ 可用於(yu) 操作抗體(ti) 的選擇通過an 抗體(ti) 依賴性細胞毒性 (ADCC)低通量和高通量篩選 (HTS) 模式下的機製。

 

優(you) 點泛毒素™, 格蘭(lan) 毒素®和CyToxiLux® 超過其他細胞毒性試驗，例如，51Cr 釋放、LDH 釋放和 PI 包括：(1) 細胞毒性作為(wei) 導致細胞死亡（細胞滲透性熒光底物裂解）的基本生化途徑進行測定，而不僅(jin) 僅(jin) 是質膜滲透性損失及其後遺症，(2) 敏感性增強，可檢測到針對亞(ya) 優(you) 勢表位的相對較弱 CTL 反應 (3) 快速性（效應子：目標共孵育時間為(wei) 0.3-2 小時），(4) 可通過流式細胞術或熒光顯微鏡僅(jin) 在靶細胞群中進行細胞死亡測定，(5) 結合免疫表型分析和多參數流式細胞術時，可直接觀察和監測細胞毒性淋巴細胞介導的主要宿主靶細胞殺傷(shang) 以及效應細胞的生理和命運。

 

靶細胞被熒光標記（紅色）然後在有熒光的情況下與(yu) 細胞毒性效應細胞共孵育底物。孵育和清洗後，可通過流式細胞儀(yi) 分析樣本。裂解底物  導致死亡細胞中綠色熒光增加。實時成像也可以用共聚焦顯微鏡進行。

 

請在開始試驗前閱讀整個方案！

 

組件供應泛毒素™ 試劑盒（足夠用於(yu)  80 含量測定） 由以下機構提供的組件 使用者

小瓶 PS（4 瓶）=PanCyToxiLux™ 底物 溶液 效應子 細胞


 

小瓶 TFL4（1 瓶）=靶細胞與(yu) 雙激光儀(yi) 器配合使用的標記物 TFL 稀釋介質（1 個(ge) 小 Eppendorf 管）= 重懸介質

針對小瓶 TFL4

靶細胞


 

清洗緩衝(chong) 液瓶（1 瓶）

 

為(wei) 了從(cong) 起始靶細胞群中消除非活細胞，例如，由於(yu) 凍融循環，請聯係 OncoImmunin,Inc.請注意：用熒光探針標記細胞表麵是不推薦，因為(wei) 這可能幹擾效應物-靶標相互作用。當按照本文中的程序使用時，TFL4 確實不標記細胞表麵。

 

格式：可使用 96 孔板或聚丙烯微量離心管進行試驗。

 

TFL4 的複溶：從(cong) 小 Eppendorf 管中取 25<unk>l 加入小瓶 TFL4。（複溶後，TFL4應儲(chu) 存在-20oC.)

 

中 T= 標記靶細胞的培養(yang) 基。複溶溶液 1<unk>lTFL4加入靶細胞生長的培養(yang) 基或生理緩衝(chong) 液如磷酸鹽緩衝(chong) 液 (PBS) 中。請注意：大多數細胞在 PBS 或不含血清的培養(yang) 基中負荷更有效。如含 10% 血清，推薦TFL4稀釋度為(wei) 1:1000，而對於(yu) 無血清緩衝(chong) 液，靶細胞標記通常用於(yu) 1:3000但是，進一步稀釋可能更優(you) 。宜TFL4單個(ge) 靶細胞類型的濃度應確定為(wei) 1:1000（含血清）和 1:3000（無血清培養(yang) 基）僅(jin) 為(wei) 建議的起始點。

 

洗滌定義(yi) 為(wei) 加入體(ti) 積的培養(yang) 基/緩衝(chong) 液，然後離心，然後小心移除試管中的所有液體(ti) 或輕彈，然後輕輕夯實平板。應使用手指輕輕移液和/或輕敲試管，重懸微丸。請勿渦旋.

 

方案

製備靶細胞

  1. 懸浮靶細胞（懸浮或胰蛋白酶化貼壁細胞）於中 T在 2 x 106細胞/ml。（這是建議的濃度。可以並常規使用較低的數字。臨界點是能夠收集到 2,000-10,000  分析用靶細胞（見下文）。）如果要用增敏劑（如多肽）衝擊靶標，則應在此階段加入後者。（如果肽溶解度需要使用有機助溶劑，後者不應超過 0.3% (v/v)，且 溶媒

207A Perry Parkway,Suite 6 V: 301-987-7881 cytotoxicity@PhiPhiLux.com

Gaithersburg,MD 20877 F: 301-987-7882 www.cytotoxicity。。ｃｏｍ


 

應包括對照管/孔。）在 37 ℃ 下孵育oC 下 0.25-1.0 小時。應確定單個(ge) 細胞類型（和致敏劑）的宜時間。請注意：對於(yu) PBL 的上樣，1:1000 稀釋TFL4在 37℃PBS 中 15'o建議使用 C。如果要將多肽與(yu) 靶標一起使用，建議是添加TFL4對於(yu) 後 15’ 的致敏劑暴露。

  1. 在此期間，製備效應細胞（見下文）。
  2. 清洗靶細胞2 次，至少超出生理體積的 10 倍每次清洗的緩衝液/培養基.
  3. 標示計數靶細胞。（此時必須對細胞進行計數，因為清洗時始終存在細胞損失。）重懸標記靶細胞在 1 x 10 下6細胞/ml清洗緩衝液。（根據實驗設計，較低濃度的靶細胞可使用。1 x 106對於 1 x 10 的情況，建議使用 cells/ml5 目標/孔或  管將為 使用。）
  4. 分配 100<unk>l靶細胞混懸液加至各試驗孔或試管中。

 

效應細胞的製備

1.  製備適當濃度的效應細胞清洗緩衝(chong) 液.   例如，對於(yu) 終效應者目標比值  的 5:1，其中 1 x 105 目標/孔或管將使用，以 5 x 10 懸浮效應細胞6 細胞/ml。

 

共孵育目標和效應細胞

  1. 向各孔或含以下物質的試管中加入 100<unk>l 效應細胞懸液靶細胞除外至少兩個孔，並加入 100

<unk>l 效應細胞懸液至至少兩(liang) 個(ge) 不含靶細胞.

  1. 加入 100<unk>l清洗緩衝液至僅含目標且僅效應物使所有樣品達到終體積 200<unk>l.
  2. 離心所有樣品，小心移除培養基，並將細胞團塊重懸於 75<unk>l 中底物來自小瓶 PSor 清洗緩衝液對於對照品（不存在底物（適用於以下管 A 和 C）。對於 ADCC，抗體應添加至  這次。
  3. 重懸後，立即通過短暫離心沉澱細胞（一旦離心機達到細胞正常使用的速度，保持 30 秒，然後停止儀器。）
  4. 在 37 ℃ 下孵育oC 為所需時間點。由於該試驗檢測的是瀕死細胞，而不是具有不可逆損傷質膜的細胞，因此給定細胞係統的孵育時間（以及 E:T）應顯著短於（和低於）其他方法。對於單個時間點測定，建議的共孵育時間為 1 小時（終端用戶時間通常在 30 min 至 2 小時之間）。相當長的時間不會 推薦。
  5. 用 200<unk>l 清洗各樣品清洗緩衝液.
  6. 重懸各樣品清洗緩衝液，如果使用酶標儀，轉移至流式細胞儀試管中或留在平板中，並通過流式細胞儀進行分析。

 

樣品總結：

  1. 靶細胞（= 靶細胞 TFL4）
  2. 靶細胞+ 底物來自小瓶 PS
  3. 效應細胞
  4. 效應細胞 +底物來自小瓶 PS
  5. 靶細胞+ 效應細胞 +底物來自小瓶 PS（多個樣本）

 

流式細胞術：請勿渦旋。  (N.B.：由於(yu) 本試驗測量的是致死打到靶細胞渦旋  強烈建議不要使用。）

應使用與(yu) 以下激發和發射峰一致的通道設置：

TFL4lex: 633 nm, lem: 657 nm

PS lex: 488 nm, lem: 520 nm

對於(yu) 為(wei) 特定探針設置軟件的儀(yi) 器：APC針對TFL4和FITC針對PS.

 

  1. 在 FSC 點圖上（x 軸）vs. SSC（y 軸），位置靶細胞（樣本 A）位於右下方並抽取門控 1如下所示（此門控用於刪除無細胞事件）：

 

 
 

 

 

  1. 使用樣品A 和D 初始設置APC（用於TFL4）和FITC（用於泛毒素™）通道，resp.：放置樣品中細胞的峰值A 接近 103在APC通道和樣品峰D at ca. 101在FITC通道。樣品 B 中的細胞應位於ca. 103在APC和 101在FITC通道，如下所示。可通過樣品 B 的 PMT 小幅調整進行優化（注：健康（台盼藍拒染法顯示 > 95% 活性）TFL4-標記靶細胞應顯示為單一群體。如果不是，首先嚐試將貼標時間縮短至 15 min。如果仍存在一個以上的種群，則減少TFL4 濃度。）


 

 

 

 
 

 

 

 

  1.  
 
 

運行剩餘(yu) 樣本。2,000-10,000靶細胞應采集每份樣本進行分析門 2（上圖和下圖）。門 2應嵌套在內(nei) 部門控 1。在以下 E:T (NK92:K562) 為(wei) 3:1 的示例中，能夠裂解 PanToxiLux 的靶細胞百分比™底物is 70.3%。這與(yu)  4.8%靶細胞單獨的背景（如上圖所示）。請注意：使用 NFL1（OncoImmunin,Inc. 提供的探針）可顯著降低該背景。需要帶有 PacBlue 通道的細胞儀(yi) （激發ca. 405 nm 和發射ca. 465 nm).

 

 

參考文獻泛毒素™

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