aatbio酶聯免疫吸附測定

aatbio酶聯免疫吸附測定（ELISA）

ELISA或酶聯免疫吸附測定法是一種基於(yu) 板的免疫測定法，用於(yu) 檢測和定量生物分子，例如抗體(ti) ，蛋白質，激素或肽，以及表征蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用。在ELISA中，通常將感興(xing) 趣的靶標（通常是抗原）固定在固體(ti) 表麵上，然後用與(yu) 諸如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合的抗體(ti) 進行探測。通過與(yu) 被酶催化的底物孵育來實現定量，從(cong) 而產(chan) 生可測量的副產(chan) 物。

目錄

1. ELISA概述
   1. 1.1 直接與間接檢測
2. ELISA格式
   1. 2.1 直接ELISA
   2. 2.2 間接ELISA
   3. 2.2 夾心ELISA
3. ELISA抗體和其他探針
   1. 3.1 HRP和多HRP二抗
   2. 3.2 HRP和AP鏈黴親和素結合物
4. ELISA底物和檢測策略
   1. 4.1 比色ELISA底物
   2. 4.1 熒光ELISA底物
   3. 4.1 化學發光ELISA底物
5. 產品訂購信息

ELISA概述（酶聯免疫吸附測定）

ELISA測定法通常在96孔聚苯乙烯微量滴定板中進行。這些板被設計成通常通過直接吸附到微量滴定板的表麵上或間接地通過預先包被的“捕獲”抗體(ti) 間接地結合和固定抗原。固定後，將一抗引入樣品中，與(yu) 抗原形成免疫複合物。一級抗體(ti) 可以共價(jia) 標記到酶（例如HRP）上，或者如果一級抗體(ti) 被生物素標記，則一級抗體(ti) 本身可以使用酶標記的二級抗體(ti) 或鏈黴親(qin) 和素偶聯物間接檢測。通過與(yu) 合適的底物孵育來評估共軛酶的活性，從(cong) 而實現檢測，該底物會(hui) 產(chan) 生可測量的副產(chan) 物。基材在靈敏度和與(yu) 成像設備的兼容性方麵各不相同，

直接與(yu) 間接檢測

在ELISA中檢測一級抗體(ti) -抗原複合物的方法可以是直接的或間接的（圖1）。在直接檢測方法中，與(yu) 報告酶（例如HRP或AP）綴合的單一一抗用於(yu) 一步步驟中，以直接檢測靶抗原。通過間接檢測，可以依次使用雙抗體(ti) 係統檢測目標靶標。首先，將樣品與(yu) 針對目標抗原的未標記一抗孵育。然後，使用一抗特異的酶標二抗檢測其存在，從(cong) 而檢測靶抗原。如果使用生物素化的一抗檢測抗原，則使用酶標記的抗生蛋白鏈菌素偶聯物作為(wei) 您的第二檢測試劑。

確定使用哪種檢測方法取決(jue) 於(yu) 靶抗原的表達水平。為(wei) 了檢測高度表達的抗原，直接檢測是合適的方法。當靈敏度至關(guan) 重要時，例如檢測低豐(feng) 度靶標或表達不良的抗原，請使用間接檢測方法來增強信號。

圖1.使用靶標特異性抗體(ti) 進行直接和間接抗原檢測的圖示。

ELISA格式

盡管存在ELISA的幾種變體(ti) ，但它們(men) 具有相似的關(guan) 鍵一步，即抗原固定。這可以通過抗原直接吸附到孔表麵來實現，也可以使用“捕獲”抗體(ti) 間接實現。在後一種方法中，固定在孔表麵的“捕獲”抗體(ti) 結合並保留抗原。固定後，酶聯抗體(ti) 可用於(yu) 檢測和量化目標靶標。考慮到所有因素，ELISA通常分為(wei) 三類：

• 直接ELISA
• 間接ELISA
• 夾心ELISA

直接ELISA

在直接ELISA中，抗原通過被動吸附直接固定在板的表麵，並使用HRP標記的一抗進行檢測。將無色底物引入樣品，該底物與(yu) 酶結合物反應，並產(chan) 生可測量的副產(chan) 物。根據底物的選擇，該副產(chan) 物可以是比色的，化學發光的或熒光的。信號產(chan) 生的大小與(yu) 樣品中抗原的數量成正比。在所有ELISA格式中，直接ELISA分析簡單，執行快，但靈敏度低。

方案：比色直接ELISA

1. 用檢測抗原包被ELISA板，密封板並在4°C下孵育過夜
2. 去除塗料溶液並用所需的緩衝液衝洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用緩衝液洗板3次
5. 與HRP標記的一抗體在室溫下孵育1小時
6. 用緩衝液洗板4次
7. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鍾。
8. 用ELISA酶標儀測量650 nm處的吸光度信號

圖2.直接ELISA圖解。

間接ELISA

間接ELISA本質上是直接ELISA的修改版本。在間接ELISA中，用於(yu) 檢測抗原的一抗是未偶聯的。取而代之的是，對一級抗體(ti) 的宿主物種具有反應性的酶標二級抗體(ti) 被用於(yu) 檢測一級抗體(ti) -抗原複合物（間接檢測抗原）。將無色底物引入樣品，該底物與(yu) 酶結合物反應，並產(chan) 生可測量的副產(chan) 物。根據底物的選擇，該副產(chan) 物可以是比色的，化學發光的或熒光的。信號產(chan) 生的大小與(yu) 樣品中抗原的數量成正比。與(yu) 直接ELISA相比，使用輔助檢測試劑具有明顯的優(you) 勢，即信號放大。

方案：比色間接ELISA

1. 用檢測抗原包被ELISA板，密封板並在4°C下孵育過夜
2. 去除塗料溶液並用所需的緩衝液衝洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用緩衝液洗板2次
5. 與未偶聯的一抗在室溫下孵育1小時
6. 用緩衝液洗板4次
7. 在室溫下與HRP標記的二抗（在封閉緩衝液中）孵育1小時
8. 用緩衝液洗板4次
9. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鍾。
10. 用ELISA酶標儀測量650 nm處的吸光度信號

圖3.間接ELISA圖解。

夾心ELISA

夾心ELISA分析是常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗體(ti) 對，從(cong) 而每種抗體(ti) 對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體(ti) ，稱為(wei) 捕獲抗體(ti) ，包被在多孔微量滴定板的表麵上，以促進靶抗原的固定。然後，第二種抗體(ti) （稱為(wei) 檢測抗體(ti) ）與(yu) 捕獲抗體(ti) -抗原複合物結合（因此，術語“三明治”因為(wei) 抗原被結合在匹配的抗體(ti) 對之間）。添加對檢測抗體(ti) （而非捕獲抗體(ti) ）具有特異性的酶標記的第二抗體(ti) 偶聯物。一旦二級抗體(ti) 與(yu) 檢測抗體(ti) 結合，

方案：比色夾心ELISA

1. 用捕獲抗體，密封板包被PCV微量滴定板的孔，並在4°C下孵育過夜
2. 去除塗料溶液並用所需的緩衝液衝洗板兩次
3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
4. 用所需緩衝液洗板2次
5. 向每個孔中添加樣品，在37°C下孵育2小時
6. 取出樣品並用所需緩衝液洗板2次
7. 與未偶聯的檢測抗體在室溫下孵育1小時
8. 用所需緩衝液洗板4次
9. 在室溫下與HRP標記的二抗（在封閉緩衝液中）孵育1小時
10. 用所需緩衝液洗板4次
11. 在室溫下用ReadiUse™TMB底物溶液（貨號11012）接種板15-30分鍾。
12. 用ELISA酶標儀測量650 nm處的吸光度信號

圖4.夾心ELISA圖。

ELISA抗體和其他探針

單克隆抗體(ti) ，多克隆抗體(ti) 或二者的組合通常在ELISA分析中用作檢測或捕獲抗體(ti) 。單克隆抗體(ti) 固有地是單價(jia) 的，對每個(ge) 抗原的單個(ge) 表位具有特異性。在所有ELISA格式中，單克隆抗體(ti) 通常用作檢測抗體(ti) 。因為(wei) 它們(men) 很少與(yu) 其他蛋白質發生交叉反應，所以它們(men) 不太可能產(chan) 生非特異性信號。相反，作為(wei) 抗體(ti) 的複雜混合物的多克隆抗體(ti) 識別在單個(ge) 抗原中發現的多個(ge) 表位。盡管它們(men) 經常在夾心ELISA分析中用作“捕獲抗體(ti) ”，以拉低盡可能多的抗原，但它們(men) 也可用作檢測抗體(ti) 。多克隆抗體(ti) 極易發生批次間變化，

ELISA二級探針

酶聯二抗或鏈黴親(qin) 和素共軛物經常用於(yu) 間接和夾心ELISA分析中。它們(men) 放大弱信號的能力使其在檢測表達不良的抗原方麵具有優(you) 勢。

HRP和多HRP二抗

辣根過氧化物酶（（HRP，目錄號11025通常與(yu) 第二抗體(ti) 或抗生蛋白鏈菌素偶聯，用於(yu) 間接或夾心ELISA分析。HRP作為(wei) ELISA報告基因的廣泛采用主要是由於(yu) 三個(ge) 因素。首先，HRP具有擴增弱信號和增強表達不良抗原的可檢測性的能力。其次，與(yu) 其他報告酶（例如堿性磷酸酶（〜140 kDa））相比，HRP的尺寸相對較小（〜44 kDa），進一步提高了細胞內(nei) 滲透到樣品中的能力，減少了空間位阻，並使免疫反應性損失小化。第三，HRP的高周轉率和良好的穩定性可實現快速而強大的信號生成。AAT Bioquest提供與(yu) HRP和poly-HRP偶聯的高度純化和交叉吸附的第二抗體(ti) 。MegaWox™聚HRP二級結合物旨在在ELISA分析中提供高水平的靈敏度和低背景。在樣品量有限或目標分子表達較差的免疫分析中使用MegaWox™聚HRP結合物。

HRP和AP鏈黴親(qin) 和素結合物

當用於(yu) 檢測抗原的一抗被生物素分子標記時，酶標記的抗生蛋白鏈菌素結合物可用於(yu) ELISA中。鏈黴親(qin) 和素的四聚體(ti) 構象使其能夠以高親(qin) 和力和選擇性結合多達四個(ge) 生物素分子。這種多樣性使得能夠放大弱信號，並提高了對中，低豐(feng) 度目標的檢測靈敏度。鏈黴親(qin) 和素以現成的形式與(yu) HRP或AP結合。

ELISA底物和檢測策略

所有ELISA分析的後一步是添加酶底物的檢測步驟。酶（例如HRP或AP）將底物催化成可測量的副產(chan) 物，並且產(chan) 生的信號強度與(yu) 樣品中的抗原量成正比。ELISA底物在易用性，靈敏度和與(yu) 成像設備（例如分光光度計，熒光計和發光計）的兼容性方麵有所不同。

比色ELISA底物

比色（或生色）底物與(yu) 酶反應生成可觀察到的有色副產(chan) 物，可以使用吸光度板讀數器進行測量。AAT Bioquest提供辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的比色底物，其靈敏度和光密度範圍都很大。

熒光ELISA底物

熒光（或熒光）底物與(yu) 酶反應生成高度熒光的副產(chan) 物，可使用熒光酶標儀(yi) 進行測量。光激發後的光子發射程度與(yu) 樣品中的抗原量成正比。AAT Bioquest提供了辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的熒光底物，其靈敏度和熒光特性均在此範圍內(nei) 。

化學發光ELISA底物

化學發光底物與(yu) 酶反應生成發光副產(chan) 物，可以使用發光計進行測量。由於(yu) 光子的發射是化學反應而非光激發的結果，因此背景幹擾小。AAT Bioquest提供了辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）的化學發光底物，其敏感性和化學發光特性均在這一範圍內(nei) 。

產品訂購信息

通用ELISA試劑盒