squarix ME043.1說明書 

目錄號編號ME043.1（RPA.1）(1 mg)

目錄號編號ME043.2（RPA.2）(5 mg)

羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 苄酯

• Fe2 + 特異性熒光“傳感器”
• 線粒體特異性
• 線粒體可螯合鐵池的測定
• 線粒體鐵攝取評估
• 病理狀態下線粒體可螯合鐵池改變的評估
• 線粒體可螯合鐵對生理和病理細胞過程的作用評估
• 鐵減少評估

熒光“鐵傳(chuan) 感器”RPA 和 RDA 選擇性測定活細胞線粒體(ti) 可螯合鐵

鐵對許多生物過程至關(guan) 重要，但也是有害的，因為(wei) 它促進產(chan) 生高度破壞性的氧物種。線粒體(ti) 可螯合鐵被認為(wei) 是導致幾種人類疾病。過去，由於(yu) 線粒體(ti) 蓄積不足或鐵選擇性指標的細胞分布均勻，試圖測定可螯合鐵的線粒體(ti) 內(nei) 池存在問題 (Lit 3)。熒光無毒的“鐵傳(chuan) 感器”RPA 和 RDA 是一個(ge) ，它允許在單個(ge) 完整線粒體(ti) 中特異性地確定這種鐵池。它們(men) 是評估不穩定（“氧化還原活性”）鐵功能的新工具，例如在自由基參與(yu) 的細胞和組織損傷(shang) 過程中。

產品信息

RPA 作為(wei) 生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chan) 率熒光標記物。透膜化合物的陽離子熒光團允許通過例如熒光顯微鏡進行觀察，並且基於(yu) 線粒體(ti) 的負膜電位，特別是靶向活細胞的線粒體(ti) 。在無細胞係統中，RPA 熒光 (max 601 nm) 被 Fe2 + 離子強烈化學計量淬滅。

1,2

1

0,8

0,6

A

例如：564 nm 發射：603 nm

120 B

100 ·

80 ·

60

RPA (µM)

• 45

0,4

30

40

20 · ·

0,2       20

0 0

· · ·

· · · · ·

450 550 650 750

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FAS (µM)

A：無細胞係統中 RPA（20 MRPA 的“簡單緩衝(chong) 液”(SBS)：2 mM 抗壞血酸鹽、0.15%SDS 和 10 mM Tris/HCl，pH 8.2）的吸光度和發射光譜。

B：Fe2 + 對“SBS”中 RPA (20-45 M) 熒光的影響：Fe2 +，作為(wei) 添加的儲(chu) 備液 (1 mM) 中硫酸亞(ya) 鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物 (FAS) 濃度的增加添加。含 20 mM 抗壞血酸鹽，與(yu) 培養(yang) 基混合。在 RPA/Fe2 + 複合物*形成後 2 min，測定含已知濃度 RPA 和 Fe2 + 的培養(yang) 基部分的熒光（以任意單位 a.u. 表示）。零熒光等於(yu) 無染料培養(yang) 基的熒光。

RPA 選擇性蓄積在培養(yang) 肝細胞的線粒體(ti) 中 (Lit 1,2)。當鐵以膜滲透形式加入細胞時，線粒體(ti) 內(nei) RPA 熒光被淬滅。當實驗可用的線粒體(ti) 可螯合鐵時，其增加

加入透膜過渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-二氮雜菲後，膜透性降低。這種 RPA 熒光的增加允許使用離體(ti) 原位校準 (Lit 1) 特異性定量活細胞中的線粒體(ti) 可螯合鐵。

在細胞係統中的應用

RPA 可按 Lit 所述使用。1. 在蓋玻片或 Pentz 小室培養(yang) 的活細胞與(yu) RPA（0.01-10µM，由 10µM 或 1 mM DMSO 儲(chu) 備液製備）在 HBBS（“Hanks 平衡 sot 溶液”）中於(yu) 37 ℃ 孵育 10-12 min。隨後用無染料 HBBS 清洗細胞 3 次。為(wei) 了避免 RPA 與(yu) 小室結合並改善線粒體(ti) 負荷，RPA 負荷後應將細胞轉移到第二個(ge) （無指示劑）Pentz 小室，再孵育 15 min。在 37 °C 條件下。現在應在 37 °C 條件下用適當的培養(yang) 基（例如肝細胞用 HBBS 或 L-15 培養(yang) 基）覆蓋細胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測定線粒體(ti) 內(nei) RPA 熒光。RPA 的紅色熒光在 exc. = 543 nm 處激發，並通過 exc. = 601 nm 附近的長通濾光片收集。定量和定性測量的掃描參數取決(jue) 於(yu) 用於(yu) 實驗的顯微鏡係統。通過加入 FeCl3/8-羥基喹啉複合物 (5-15µM) 或膜滲透性鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酸腙，2 mM）或 1,10-二氮雜菲 (2 mM)，開始測定後 5-10 min 可控製可螯合鐵的線粒體(ti) 內(nei) 水平。對於(yu) 對照測量，平行培養(yang) 物上樣含有相同熒光團的鐵不敏感對照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基] 苄基酯）。應使用與(yu) 上述相同的加載條件。

原位校準

通過比較 PIH (2 mM)“去淬滅”後的線粒體(ti) 熒光（任意單位）與(yu) 溶解在“線粒體(ti) 培養(yang) 基”中的 RPA 標準品 (5-80µM) 的熒光，測定線粒體(ti) 內(nei) RPA 濃度的離體(ti) 校準（組成見文獻 1）。為(wei) 了獲得校準曲線，將 100µl 已知 RPA 濃度的培養(yang) 基部分置於(yu) 細胞實驗中使用的相同蓋玻片上。在無細胞離體(ti) 測量中，使用與(yu) 細胞熒光定量測量相同的焦平麵和激光掃描參數。

Fe2 + 誘導 RPA 熒光猝滅的離體標定

1 mL“線粒體(ti) 培養(yang) 基”（見 Lit.1）轉移至 1.5 mL 試管中，37 ℃ 孵育。加入 RPA (20-80µM)。加入新鮮製備的含 20 mM 抗壞血酸鹽的貯備液 (1 mM) 中已知濃度的 FAS（硫酸亞(ya) 鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物）。RPA/Fe2 + 在應用期間形成。2 min 孵育時間。通過使用與(yu) 細胞熒光定量測量和離體(ti) 校準相同的焦平麵和激光掃描參數測量 RPA 熒光，獲得校準曲線。

產品數據

產(chan) 品名稱： RPA

產(chan) 品代碼： ME043.1 (1 mg) 和 ME043.2 (5 mg)

化學名稱： 羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 苄酯

分子式： C48H44N5O4Br

分子量： 834g/mol

大吸收： max (log) = 564 nm (4.95) ,510-535 寬肩峰

發射大值： 大值 601 nm

穩定性： < 4 ℃，幹燥避光儲(chu) 存

外觀： 紫色固體(ti)

純度： > 97% (1H NMR，500 MHz)

淬滅化學計量學： RPA/Fe2 + :3:1[mol/mol]

體(ti) 外毒性： 無毒

使用注意事項

該產(chan) 物作為(wei) 生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chan) 率熒光標記物，尤其是在活細胞的線粒體(ti) 中。可通過熒光光譜法、熒光板進行測量  讀者，  FACS，  視頻顯微鏡  和  激光掃描顯微鏡。  可在 DMSO 中製備 1 mM-5 mM RPA 儲(chu) 備液，等份試樣應在-20 ℃ 避光保存。當在-20 ℃ 下適當儲(chu) 存時，溶液可使用至少 2-3 個(ge) 月。

訂購信息

*有關(guan) 散裝包裝規格，請谘詢。價(jia) 格不含運費，請谘詢。 後更新日期：2020 年 1 月

文獻

1. 用新型熒光傳感器選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵；

F. Petrat 等人生物化學。J. (2002) 362,137-147

1. 冷誘導的肝細胞凋亡：非線粒體可螯合鐵觸發的線粒體通透性轉換；U. Rauen et al.《自由基生物學與醫學》2003 年第 35 卷第 12 期第 1664-1678 頁
2. 活細胞中的可螯合鐵池：係統確定的量；F. Petrat et al.生物學化學，第 383 卷，第 489-502 頁，2002 年
3. 利用不同鐵結合親和力的線粒體選擇性熒光鐵指示劑評估可螯合線粒體鐵。U. Rauen 等人ChemBioChem 2007,8,341-352
4. 線粒體烏頭酸酶的氧化失活導致大鼠原代中腦培養物中鐵和 H2O2 介導的神經毒性。David Cantu 等人PlosOne，2009 年 9 月，第 4 卷，第 9 期，第 1-9 頁
5. Tryparedoxin 過氧化物酶缺陷使錐蟲發生鐵噬型細胞死亡。M. Bogacz 等人細胞生物學，2018 年 7 月
6. 線粒體鐵蛋白限製氧化損傷調節線粒體鐵的有效性：Friedreich 共濟失調的保護作用假說。Alessandro Campanella 等人嗯。摩爾遺傳學2009,Jan 1;18 (1) :1-11
7. 紅細胞對非轉鐵蛋白鐵的攝取。Eugenia Prus 等人貧血。2011;2011:945289
8. 線粒體鐵螯合可預防癲癇發作誘導的線粒體功能障礙和神經元損傷。Li-Ping Liang 等人神經科學雜誌 2008 年 11 月 5 日，28 (45) 11550-11556
9. 線粒體鐵的減少減輕了損傷過程中的心髒損傷。Hsiang-Chun Chang 等人EMBO 分子醫學：8 (3) (2016)，247-267
10. 阿黴素的心髒毒性是通過線粒體鐵蓄積介導的。Yoshihiko Ichikawa 等人心髒病學。臨床研究雜誌2014 Feb 3;124 (2) :617–630.
11. 鐵螯合劑用於治療和預防缺血事件後的細胞死亡和器官損傷。Hossein Ardehali 等人2016 年。US20170014397A1，
12. 線粒體鐵和能量功能障礙將成纖維細胞和誘導的神經元與泛酸激酶相關的神經退行性變患者區分開來。Paolo Santambrogio 等人疾病神經生物學，第 81 卷，2015 年 9 月，第 144-153 頁
13. Shawn 是 SLC25A39/40 的果蠅同係物，是一種促進神經元存活的線粒體載體。Jan R. Slabbaert 等人神經科學雜誌 2016 年 2 月 10 日，36 (6) 1914-1929。
14. 鐵調節蛋白缺乏損害小鼠胚胎成纖維細胞的線粒體功能。李慧慧等。等人Nature,Scientific Reports 第 8 卷，文章編號：5118 (2018)
15. 鐵螯合劑複合物作為早期發育的人紅係前體的鐵源。J.M. Leimberg et al.,Translational Research 2008,151:88-96
16. Friedreich 共濟失調，人淋巴母細胞和成纖維細胞中線粒體不穩定鐵無變化。

F. Petrat 等人，J. biology。化學280,8,February 25,pp. 6701–6708,2005

1. 選擇性抑製細胞質而不是線粒體核糖體的氨基糖苷類設計者表現出耳毒性降低。Timor Baasov 等人，J. biol。化學289/4，第 2318–2330 頁。2014-01-24