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Protocol for using the ChemoTx® System

ChemoTx® 一次性趨化係統 ChemoTx 係統是標準微孔板格式的一次性趨化/細胞遷移室，96 孔或 384 孔。它與(yu) 大多數熒光和密度測定酶標儀(yi) ，以及大多數液體(ti) 分配機器人兼容。目前有 3 個(ge) 平板可用，2 個(ge) 為(wei) 96 孔板，微孔體(ti) 積為(wei) 30 或 300µ，1 個(ge) 為(wei) 384 孔板，微孔體(ti) 積為(wei) 10µ。均由組織培養(yang) 級透明聚苯乙烯製成。聚碳酸酯軌道蝕刻 (PCTE) 過濾器粘合到金屬框架上，並在每個(ge) 測試部位周圍選擇性地塗上疏水掩模。這種麵罩允許將細胞懸液直接移液到過濾器頂部的位點上，在那裏它呈半球形液滴，從(cong) 而消除了上層孔的需要。過濾器底部和板邊緣之間的密封也由疏水麵罩提供，消除了墊圈和夾緊硬件。通過這種設計，頂部和底部液體(ti) 中的氣泡截留小化：在頂部，因為(wei) 沒有“孔”截留氣泡；在過濾器下方，因為(wei) 孔邊緣和過濾器底麵之間的密封是水密封，而不是蒸汽密封，因此氣泡可能逸出。

使用 Neuro Probe 96 孔 ChemoTx® 係統填充微孔板的方案 ChemoTx®96 孔微孔板含有 30µL 或 300µL 液體(ti) 。使用 300µL ChemoTx® 板時，請參考括號中的體(ti) 積。移液器，尤其是多通道移液器實際分配量的變化可能相當大。為(wei) 了幫助彌補這一點，ChemoTx® 微孔板設計有碟形邊緣。這種微孔邊緣設計允許每個(ge) 微孔中的體(ti) 積在 27µL-31µL (295µL-303µL) 之間，且結果良好。相應地，將移液器設置為(wei) 29µL (299µL)，以便即使在遞送體(ti) 積變化±2µL (±4µL) 後，您仍處於(yu) 正確範圍內(nei) 。當微孔中的體(ti) 積在 27-29µL (295-299µL) 之間時，應用後過濾器下似乎會(hui) 截留氣泡。從(cong) 上方觀察時，微孔將是這樣的：然而，這不是一個(ge) 捕獲的氣泡。孔邊緣和過濾器底部之間的密封僅(jin) 為(wei) 水封，而非空氣密封。因此，當用移液器將細胞懸液吸取到過濾器頂部時，1-2μl 培養(yang) 基 (1-5μl) 可流經過濾器並置換空氣

過度灌裝如果微孔過度灌裝，應用過濾器迫使過量液體(ti) 溢出邊緣並破壞水性密封件。然後，當您將細胞懸液添加到過濾器頂部時，孔可能會(hui) 泄漏。下圖表示過度填充微孔的後果：n 填充不足如果您向微孔中移取的液體(ti) 太少，過濾器的底麵將不會(hui) 接觸液體(ti) 。這可防止細胞懸液與(yu) 微孔板中的液體(ti) 接觸，並捕獲孔中的空氣，防止擴散和遷移。n 故障排除我們(men) 建議您的移液器初始設置為(wei) 29µL (299µL)。然而，由於(yu) 每個(ge) 移液器不同，您可能需要優(you) 化移液器設置。填充一列孔並應用過濾器。查看過濾器頂麵，查看過濾器與(yu) 孔中液體(ti) 接觸區域周圍是否有幹燥的環狀物。如果微孔中的液體(ti) 與(yu) 過濾器之間沒有接觸，則它們(men) 被填充不足。如果有液體(ti) 溢出邊緣的井，則它們(men) 被過度填充。調整移液器設置，以補償(chang) 這些問題的出現。如果您正在使用多通道移液器，並且您在同一列中同時存在這兩(liang) 個(ge) 問題，則：a）一個(ge) 或多個(ge) 吸頭與(yu) 移液器之間存在泄漏；b）一些吸頭上的汙染導致液體(ti) 分配不均；c）您的移液器太不準確，無法與(yu) ChemoTx® 配合使用，或 d）上述幾項。如果 a），重新固定移液器吸頭；如果 b），加載新的幹淨吸頭；如果 c）或 d），嚐試使用不同的移液器。

如果在幾個(ge) 微孔上偶爾發生輕微填充不足，可以通過使用幹淨的圓形末端玻璃攪拌棒（或類似儀(yi) 器）輕輕向下推動過濾器頂部，直至過濾器與(yu) 液體(ti) 接觸來克服。一旦接觸，當在過濾器頂部移液時，細胞懸液中的液體(ti) 將取代微孔頂部的空氣。質控品除正常陰性質控品外，我們(men) 還建議將已知使用的細胞懸液係列稀釋液移液到一行或一列孔中。在這些微孔上方的過濾部位，請勿移取細胞懸液。在這些孔中移取與(yu) 過濾器頂部位置相同體(ti) 積的液體(ti) 為(wei) 方便。如果您正在使用 30µL 微孔板上具有 5.7 mm 微孔位點的過濾器，則必須對該技術進行體(ti) 積調整。讀取平板讀數時，該連續稀釋度作為(wei) 標準或度量，與(yu) 實驗孔讀數進行比較。例如，如果實驗中每個(ge) 位點使用 10000 個(ge) 細胞，則吸取 10000 個(ge) 細胞到 A1 中，5000 個(ge) 細胞到 B1 中，2500 個(ge) 細胞到 C1 中，…，78 個(ge) 細胞到 H1 中。定位濾器並添加細胞懸液當微孔板上加載化學引誘物和對照物時，將有框濾器置於(yu) 其上方，並將濾器框架角落的孔與(yu) 微孔板上的四個(ge) 針頭對齊。確過濾器上的 A1 位點位於(yu) 微孔板上的 A1 孔上。向下用力按壓框架的四個(ge) 角，直到其緊貼在微孔板邊緣。注意框架必須與(yu) 板的周緣接觸才能正常工作。（參見上述照片。）
 

有框濾波器也有兩(liang) 種配置。直徑為(wei) 3.2 mm 的部位暴露麵積為(wei) 8 mm2，而直徑為(wei) 5.7 mm 的部位暴露麵積為(wei) 25 mm2如果您使用的是 3.2 mm 的位點，則用移液器吸取 20µL-25µL 細胞懸液至每個(ge) 位點（上述推薦的任何連續稀釋孔除外）。如果您使用的是 5.7 mm 部位，則移取 50µL-60µL 細胞懸液。垂直握住移液管，緩慢均勻地擠出細胞懸液。我們(men) 推薦一種作用緩慢、平穩的移液器；電子多通道移液器是該應用的理想選擇。請使用這些麵積和體(ti) 積數據，結合下表中的孔隙密度，確定待加載的適當細胞數量和適當的細胞濃度。孔徑孔隙密度 2µm 2 x 104 孔/mm2 3µm 2 x 104 孔/mm2 5µm 4 x 103 孔/mm2 8µm 1 x 103 孔/mm2 10µm 1 x 103 孔/mm2 12µm 1 x 103 孔/mm2 讀取 ChemoTx® 過濾器和微孔板孵育後，取下蓋子，過濾器仍在原位，取出細胞懸液。這可以通過使用實驗室濕巾吸幹來完成。然後用小刮匙型細胞收集器或棉簽輕輕擦拭過濾器頂部的細胞。在水槽或容器上以 45° 的角度固定微孔板和連接的過濾器，並使用介質小心衝(chong) 洗過濾器的頂麵。將培養(yang) 基應用於(yu) 過濾器的頂部邊緣，並使其輕輕流過過濾器表麵。目標是從(cong) 頂麵去除未遷移的細胞，而不幹擾已通過過濾器遷移的細胞。