材料加工實驗方案：


1. 培養(yang) 孔包被程序： 使用這些建議作為(wei) 指導來確定適合您的培養(yang) 係統的最佳包被條件。

  1. 從(cong) 瓶子中取出所需數量的絲(si) 溶液並分配到稀釋容器中。

  2. 用水稀釋絲(si) 溶液至 1 mg/mL (1:50)。

  3. 輕輕旋轉內(nei) 容物，直到材料*混合。

  4. 在培養(yang) 表麵加入適量的稀釋絲(si) 溶液，確保整個(ge) 表麵都被塗層。

  5. 在無蓋的室溫下在幹淨的工作台 (ISO 100) 中孵育 2-3 小時以*幹燥。

  6. 孵化後應用 70% 甲醇 20 分鍾以誘導不溶於(yu) 水的絲(si) 綢表麵。

  7. 用無菌培養(yang) 基或 PBS 仔細衝(chong) 洗塗層表麵。不要刮傷(shang) 表麵。

  8. 塗層表麵可供使用或可在 4°C 下儲(chu) 存以備將來使用。

2. 濃縮絲(si) 溶液： 如果需要更高的絲(si) 濃度，則使用此技術。更高的絲(si) 濃度對於(yu) 特定的加工技術或修改最終材料特性可能很重要。

  1. 準備 10% (W/V)。聚乙二醇 (PEG, 10K MW) 與(yu) 去離子水的溶液。與(yu) 磁性攪拌板上的大攪拌棒混合，直到 PEG *溶解。

  2. 獲得分子量截止在 3,500 和 10,000 Da 之間的透析膜。如有必要，按照製造商的要求對透析盒進行水合。

  3. 根據透析膜製造商的填充量指南，用適量的 5% 絲(si) 溶液填充透析膜。

  4. 將填充絲(si) 溶液的透析膜放入 10%（重量/體(ti) 積）PEG 溶液中並蓋上。

  5. 指明盒式磁帶添加到溶液中的時間和日期。典型的濃縮時間將根據所需的絲(si) 溶液最終濃度、被濃縮的絲(si) 溶液的體(ti) 積和使用的透析膜而變化。
    注意 作為(wei) 典型示例，10 mL 的 5% 蠶絲(si) 溶液在 10% (W/V) PEG 透析 20-22 小時後將產(chan) 生 2-4 mL 濃縮蠶絲(si) 溶液。通常，通常根據用戶要求推薦優(you) 化運行。

  6. 濃縮時間結束後，從(cong) PEG 浴和透析盒中取出濃縮的絲(si) 溶液，並將絲(si) 溶液儲(chu) 存在 4°C 以備將來使用。注意：絲(si) 綢溶液的保質期隨著濃度的增加而縮短，因此在生產(chan) 後 1 周內(nei) 盡快使用濃縮的絲(si) 綢溶液。

  7. 蠶絲(si) 溶液濃度可以通過重量百分比濃度來確定。為(wei) 此，請在精密天平上稱出大約 100 μL 的濃縮絲(si) 溶液並記錄濕重。讓溶液幹燥成薄膜並測量絲(si) 蛋白幹重。將幹重除以濕重並乘以 100% 得到溶液的重量百分比濃度。

3. 獨立式絲(si) 膜： 這種加工方法生產(chan) 的獨立式絲(si) 膜材料可用於(yu) 細胞培養(yang) 或體(ti) 內(nei) 移植。獨立式絲(si) 膜具有易於(yu) 從(cong) 培養(yang) 條件中移除以進行進一步樣品分析的優(you) 勢。

  1. 將 7 mL 的 5% 絲(si) 溶液添加到 100 mm 培養(yang) 皿中，並允許在幹淨的工作台環境中裸露幹燥。這通常需要幾個(ge) 小時，最好過夜。

  2. 形成的薄膜厚度約為(wei) 40-60 µm，可以使用鑷子從(cong) 培養(yang) 皿中取出。增加蠶絲(si) 溶液的量或使用更高濃度的蠶絲(si) 溶液會(hui) 產(chan) 生更厚的薄膜。

  3. 這些薄膜目前是水溶性的，可以使用以下任一方法使其不溶於(yu) 細胞培養(yang) ：

一世。甲醇浴培養(yang) ：
a．用 70% 甲醇和 30% 去離子水填充盤子並混合。
灣。將絲(si) 膜放入甲醇溶液中 10 分鍾。
C。去除絲(si) 膜並用無菌水或適當的介質衝(chong) 洗。
    注意： 這種處理方法可以快速產(chan) 生不溶性絲(si) 膜材料特性，這些特性往往是不透明的、更疏水的，並且原位降解速度慢。

ii. 水退火：
a．獲得一個(ge) 清空的實驗室真空幹燥器，並在底部部分填充水。
灣。將薄膜放在水麵上方的架子上，蓋上蓋子，然後拉 25 in Hg 真空。
C。停止公雞室，並允許坐 4 小時。
d。從(cong) 腔室中取出樣品並用 70% 乙醇消毒，然後用無菌水或適當的介質衝(chong) 洗。
   注意：這種加工方法產(chan) 生的不溶性絲(si) 膜材料特性往往是透明的，更親(qin) 水，並且在原位降解速度快。

  1. 如果不立即使用，可以將薄膜切割成型並在室溫下儲(chu) 存 2 年或更長時間。
    注意： 絲(si) 膜也可以澆鑄到帶圖案的表麵上以複製表麵形貌，通常使用矽橡膠或類似材料來輕鬆去除絲(si) 材料。此外，由於(yu) 潛在的材料浮力，可能需要使用加權方法來保持薄膜浸沒在介質中。

4.  3D Silk Sponge Scaffolds： 這種處理方法為(wei) 體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 應用或原位植入創建 3D 多孔支架。支架孔徑和可降解特性也可以使用以下方法進行調整。

A. 將蠶絲(si) 溶液等分到所需的成型容器中，建議使用聚四氟乙烯，以便於(yu) 去除材料。

B. 對於(yu) 每個(ge) 正在製備的樣品，稱量必要量的鹽，以保持鹽與(yu) 絲(si) 的重量比為(wei) 25:1。
注意：對孔徑的控製取決(jue) 於(yu) 所選的氯化鈉（鹽）晶體(ti) 尺寸。如果確定的孔徑大小，請使用不鏽鋼篩網以產(chan) 生均勻的鹽晶體(ti) 大小。對於(yu) 750 µm 及更大的鹽顆粒，建議將蠶絲(si) 溶液濃縮至 8% 或以上。

C. 在旋轉模具的同時將鹽緩慢添加到蠶絲(si) 溶液中，以使鹽添加均勻。確保通過輕微攪拌或敲擊表麵小心去除因材料移位而形成的氣泡。

D. 蓋上模具，讓溶液在室溫下靜置 1-2 天，以形成絲(si) 質支架。

E. 支架形成後，取下模具蓋，將樣品放入 2 升 DI 燒杯中，然後放在攪拌板上。

F. 48小時內(nei) 每8-12小時換一次水。

H. 洗滌期結束後，從(cong) 模具中取出形成的支架並放入最後的去離子水中衝(chong) 洗 24 小時，以確保*去除殘留的鹽分。

I. 支架可在去離子水中 4 °C 儲(chu) 存或在室溫下幹燥直至需要。

J. 腳手架可切割成所需尺寸並在使用前進行蒸汽滅菌

5. 3D Silk Hydrogels： 這種加工方法可用於(yu) 生產(chan) 絲(si) 水凝膠，用作可注射生物材料、體(ti) 外培養(yang) 和體(ti) 內(nei) 使用。

A. 將 5% 的絲(si) 溶液放入所需的成型容器或小瓶中。

B. 用膠帶將容器或小瓶垂直固定到實驗室渦旋儀(yi) 上。

C. 以最大轉速渦旋溶液幾分鍾。這些參數需要針對給定的絲(si) 溶液體(ti) 積和模具幾何形狀進行優(you) 化。

注意：例如，將 1 mL 的絲(si) 溶液移液到玻璃小瓶中，並在 3,200 RPM 下渦旋約 7 分鍾。溶液應增加濁度，表明膠凝過程已開始。

注意：一旦溶液被渦旋，在凝膠化完成之前不要將溶液轉移到第二個(ge) 容器中。

D. 將渦旋絲(si) /成型容器/小瓶置於(yu) 37 °C 培養(yang) 箱中過夜，以加快凝膠時間。

E. 絲(si) 水凝膠隻要保持水分並儲(chu) 存在 4°C 的去離子水中，就可以用於(yu) 未來使用。