線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒(JC-1))說明書(shu)

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產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒(JC-1)是利用 JC-1 作為(wei) 膜電位識別的熒光探針，能夠快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體(ti) 膜電位變化，用於(yu) 早期的細胞凋亡檢測。

JC-1 是一種廣泛用於(yu) 檢測線粒體(ti) 膜電位△Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體(ti) 膜電位。其檢測原理為(wei) ：當 JC-1 進入細胞後，正常細胞中線粒體(ti) 膜電位較高，在此條件下 JC-1 會(hui) 聚集在線粒體(ti) 的基質中，形成聚合物，進而產(chan) 生紅色熒光；當線粒體(ti) 膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體(ti) 的基質中， 此時 JC-1 以單體(ti) 存在，產(chan) 生綠色熒光。實際使用過程中，我們(men) 通常通過比較紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體(ti) 去極化的程度，方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體(ti) 膜電位的變化。線粒體(ti) 膜電位的下降是細胞凋亡早期的標誌性事件。通過 JC-1 從(cong) 紅色熒光到綠色熒光的轉變，可以很快速地捕捉到細胞膜電位的下降；同時紅色到綠色熒光的轉變，也可以作為(wei) 細胞凋亡早期的一個(ge) 檢測指標。JC-1 單體(ti) 的最大激發波長為(wei)  515nm，最大發射波長為(wei)  529nm；JC-1 聚合物的最大激發波長為(wei) 585nm，最大發射波長為(wei)  590nm。觀察時，使用常規的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。本試劑盒提供 CCCP 作為(wei) 誘導線粒體(ti) 膜電位下降的陽性對照。

產(chan) 品組成

包裝清單：

使用本試劑盒檢測 A549 細胞在正常和造模前後的線粒體(ti) 膜電位的效果圖。正常 A549 細胞經 JC-1 染色後以聚合物形式存在，呈明亮的紅色熒光，綠色熒光很弱；使用 CCCP（10μM）誘導使線粒體(ti) 膜電位下降後，JC-1 以單體(ti) 存在形式居多，因此線粒體(ti) 內(nei) 紅色熒光強度顯著降低，而綠色熒光顯著增強。

運輸與(yu) 保存

-20℃避光保存，避免反複凍融。JC-1緩衝(chong) 稀釋液4℃保存，至少2周內(nei) 有效。

實驗步驟

1. JC-1 染色工作液的配製：

取適量 JC-1 (200X)，按照每 5µl +995 μl JC-1 緩衝(chong) 稀釋液（1X）的比例稀釋至 1X JC-1 染色工作液。 注：試劑盒標配 JC-1 緩衝(chong) 稀釋液為(wei)  10X，使用前用三蒸水稀釋至 1X 使用，配置前應於(yu)  37℃水浴至室溫後方可使用，以免稀釋液過冷染色過程對細胞有刺激影響實驗結果，稀釋時將JC-1 緩衝(chong) 稀釋液（1X）快速加入到 200X 的 JC-1 母液中稀釋效果更佳。一般建議 6 孔板每孔使用 JC-1 染色工作液量為(wei)  1ml，其它培養(yang) 器皿用量以此類推。對於(yu) 細胞懸液每 5-10*106 細胞加 0.5ml JC-1 染色工作液（1X）。

2. 陽性對照組：

該試劑盒包含陽性對照 CCCP（10 mM），CCCP 可以誘導細胞線粒體(ti) 膜電位變化。使用方法：用細胞培養(yang) 液配製 CCCP，推薦終濃度為(wei)  10 µM，對於(yu) 不同細胞 CCCP 濃度可自行調整。正常條件下，10 µM CCCP處理 20 分鍾後線粒體(ti) 的膜電位會(hui) 明顯改變，此時，JC-1 染色後可觀察到明顯的綠色熒光；相反，正常的細胞經 JC-1 染色後顯示紅色熒光。

3. 懸浮細胞處置：

a) 取5-10*106細胞，用0.5ml 細胞培養(yang) 液重懸細胞。

b) 加入0.5ml JC-1染色工作液，顛倒數次混勻。置於(yu) 細胞培養(yang) 箱中37℃孵育20-30分鍾；不同細胞根據實驗可自行調整染色時間。

b) 孵育結束後，700g 4℃離心，收取沉澱細胞。

c) 用JC-1 緩衝(chong) 稀釋液（1X）洗滌 2-3 次：加入 1 ml JC-1 染色工作液重懸細胞，隨後用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用流式細胞儀(yi) 分析。

4. 貼壁細胞處置：

a) 6 孔板貼壁細胞處理過程如下：首先，棄培養(yang) 液，用常溫 PBS 或培養(yang) 液輕洗細胞2次，加入1ml新鮮細胞培養(yang) 液。陽性對照組中加入CCCP（終濃度 10 µM）提前置於(yu) 孵箱中處理20-30分鍾；

b) 隨後，加入1ml JC-1 染色工作液，充分混勻。置於(yu) 培養(yang) 箱中 37℃孵育30-60分鍾不等（可根據實驗情況調整）。

d) 孵育結束後，棄上清，用 JC-1 緩衝(chong) 稀釋液（1X）洗滌細胞 2 次。

e) 加入 1 ml 細胞培養(yang) 液，於(yu) 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 純化的線粒體：

a) 1 ml 染色體(ti) 係包含：0.9 ml JC-1 染色工作液+0.1ml純化的線粒體(ti)  (10-100µg)；置於(yu) 37℃孵育 20-30 分鍾，期間可上下顛倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育結束後，可用熒光分光光度計或熒光酶標儀(yi) 檢測：熒光分光光度計檢測：激發波長為(wei) 485nm，發射波長為(wei)  590 nm。熒光酶標儀(yi) 檢測時，激發波長可在 475-520 nm 範圍內(nei) 設置。具體(ti) 可參考步驟6中的條件進行熒光檢測。

c) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同步驟6。

6. 熒光檢測與數據分析：

JC-1 單體(ti) 的激發波為(wei)  490 nm，發射光波長為(wei)  530 nm；JC-1 聚合物，激發波長為(wei)  525 nm，發射波長為(wei)

590 nm。實際測試過程中，可依據實驗室儀(yi) 器的相關(guan) 參數進行設置，不必把激發和發射波長設置在最大激發波長和最大發射波長。熒光顯微鏡或共聚焦觀察時，JC-1 單體(ti) 的檢測可參照其它綠色熒光時的設置，如GFP 或 FITC 通道；同理，JC-1 聚合物的檢測時可以參考其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 的設置。因此， 出現綠色熒光說明線粒體(ti) 膜電位下降，我們(men) 可以通過比較紅綠熒光的相對比例衡量線粒體(ti) 膜電位的變化。

注意事項

8. 注意事項：

a) JC-1 探針母液（A 試液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；盡量減少反複凍融。

b) JC-1  緩衝(chong) 稀釋液（B 試液）：如需無菌操作，使用前可用 0.2μm 濾膜過濾後裝瓶使用即可。4℃保存，至少2周內(nei) 有效。

  c) CCCP（C 試液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；盡量減少反複凍融。洗滌時也可以用 Hanks' Balanced Salt Solution、PBS 等替代JC-1 緩衝(chong) 稀釋液。