雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (高通量）說明書(shu)

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬於(yu) 菲律宾新利官网开户（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優(you) 質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chan) 業(ye) 鏈中的國產(chan) 生物試劑品質關(guan) 。未來讓每一個(ge) 和我們(men) 一樣擁有民族情懷的企業(ye) ，共同創世界優(you) 秀的中國生物製造企業(ye) ，圓夢中國。

產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

報告基因檢測常用於(yu) 研究真核生物基因表達調控，螢火蟲螢光素酶 和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發出生物螢光(bioluminescence)，這種發光反應具有良好的光學特征和濃度線性範圍，同時檢測的靈敏度高，可達到 10-20mol。兩(liang) 種催化反應最適濃度不同，因此互不幹擾， 配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報告基因檢測係統，其中海腎螢光素酶常作為(wei) 內(nei) 參照。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為(wei)  61 kDa 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此過程中會(hui) 發出波長約為(wei)  560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為(wei)  36 kDa 的蛋白，在氧氣存在的條件下，催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide，在此過程中會(hui) 發出波長約為(wei)  480 nm 的生物螢光。在後加入海腎螢光素酶底物時，可有效淬滅螢火蟲熒光素酶催化 luciferin 的發光，而不幹擾海腎螢光素酶的活性，從(cong) 而實現雙螢光素酶報告基因檢測。生物螢光可以通過化學發光儀(yi) (luminometer)或)或多功能酶標儀(yi) 進行測定。通過螢光素酶與(yu) 其底物催化發光的體(ti) 係，可以高效、靈敏地檢測基因的表達。檢測原理如圖所示：

圖 1.熒光素酶報告基因反應原理圖

產(chan) 品組成

試劑盒組分：

運輸與(yu) 保存

冰袋運輸，-20℃保存 6 個(ge) 月，-80℃保存更長時間。

實驗步驟

1. 試劑準備：

（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需體(ti) 積的 5x Universal lysis Buffer 臨(lin) 用前用三蒸水稀釋至1x；

（2）Fluc buffer A 工作液：試劑盒開始啟用時，將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中，適當吹打搖勻至粉末充分溶解後，分裝到棕色管中-20℃保存備用；

（3）Rluc Buffer B 工作液：臨(lin) 用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nei) 使用有效（試劑配置過程中注意避光）。

2. 細胞裂解:

（1） 細胞裂解：取出孔板放置至恢複室溫，加入適量體(ti) 積 1x ULB 振蕩器搖勻，室溫裂解 15min。細胞裂解液推薦使用量：

（2） 熒光酶標儀(yi) 設定，正確開啟儀(yi) 器，點擊檢測，選擇生物發光檢測功能，根據本批樣本的靈敏度選擇合適增益與(yu) 積分時間，默認為(wei) 增益 135，積分時間 10 s。

3. 檢測：

1)移液槍吹打混勻裂解液後，吸取 20 μL 到黑色孔板底部。（樣品數量過多時候建議使用移液槍經轉移和後續加液操作，若使用四周不透光的培養(yang) 板可省略轉移操作）

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A，輕柔快速吹打混勻三次後，室溫孵育反應 5-10min 後，上機檢測記錄發光值（F 值）。

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B，輕柔快速吹打混勻三次後，室溫孵育反應 5-10min 後，上機檢測記錄發光值（R 值）。

（為(wei) 保證結果準確性，在加入 Fluc buffer A 或Rluc buffer B 後，請在 1h 內(nei) 完成檢測）

實驗案例分析

在 96 孔板中接種適量細胞過夜至貼壁狀態，第二天進行如下轉染：1.含有FXR 基因啟動子區的熒光素酶報告基因表達載體(ti) 質粒；2.含有 FXR 基因啟動子區轉錄因子 E2 功能的重組表達載體(ti) 質粒；3.海參熒光素酶重組表達載體(ti) 質粒。轉染 6h 向每孔中加入不同單體(ti) 藥物培養(yang)  48h，其中設置空白溶劑 DMSO 組。最後按試劑盒說明書(shu) 操作裂解隨後進行熒光素酶報告基因活性檢測，結果如下（對應孔中所標白色字體(ti) 數值為(wei) 陽性激動劑的激動倍數）

圖 3 . 59 種單體(ti) 藥物對X 基因啟動子區熒光素酶報告基因激動倍數熱圖（A1:為(wei) 空白溶劑對照組；A2-J6: 59

種 FDA 上市藥物的實驗組）

經過上述實驗的高通量篩選確定 F3 孔對應單體(ti) 藥物對FXR 啟動子區激動效果強，激動倍數為(wei)  45。同某進口“P"品牌一同測定該藥物對FXR 基因的激動曲線，並計算 EC₅₀，結果如下：

圖 4.紅色：起發生物品牌測定 F3 單體(ti) 藥物激動 FXR 基因啟動子區熒光素酶報告基因響應曲線；黃色：進口“P"品牌測定F3 單體(ti) 藥物激動 FXR 基因啟動子區熒光素酶報告基因響應曲線（EC50）

1. 數據分析：

（1）實驗設計：根據實驗目的，每組實驗均應設置空白對照組，對照組和處理組。

a. 空白對照組

背景 F：未轉染細胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未轉染細胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白對照組樣品量須與(yu) 實驗樣品量相同，且與(yu) 實驗樣品含有相同的培養(yang) 基/血清組合。

b. 對照組：轉染細胞未經實驗因素處理 (即對照組 F 和對照組 R)。

c. 實驗組：轉染細胞經實驗化合物處理 (即實驗組F 和實驗組 R)。

計算結果：對照組比值=(對照組 F-背景 F)/(對照組 R-背景 R)，實驗組比值=(實驗組 F-背景 F）/(實驗組 R-背景 R)。

表達倍數= 實驗組比值/對照組比值。

注意事項

（1） 反應溫度：酶促反應對溫度較為(wei) 敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養(yang) 液平衡至室溫（20-25℃）。

（2） 檢測儀(yi) 器：能檢測化學發光的儀(yi) 器都適用，但由於(yu) 不同儀(yi) 器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會(hui) 不同。 檢測板：為(wei) 防止孔間幹擾，推薦使用不透光酶標板。

（3） 發光信號會(hui) 受到檢測環境如培養(yang) 基組分、溫度等影響，應確保同組內(nei) 不同樣本檢測條件一致。

（4） 為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套。

（5） 本產(chan) 品僅(jin) 作科研用途！