發光法支原體檢測試劑盒說明書

發光法支原體(ti) 檢測試劑盒說明書(shu)

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬於(yu) 菲律宾新利官网开户（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優(you) 質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chan) 業(ye) 鏈中的國產(chan) 生物試劑品質關(guan) 。未來讓每一個(ge) 和我們(men) 一樣擁有民族情懷的企業(ye) ，共同創世界優(you) 秀的中國生物製造企業(ye) ，圓夢中國。

產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》通過檢測支原體(ti) 含有的特異性 ATP 合成相關(guan) 酶的活性以達到檢測體(ti) 外培養(yang) 的哺乳動物細胞是否被支原體(ti) 汙染的目的。

在支原體(ti) 裂解後，該支原體(ti) 特異性的酶，在底物存在下，具有將 ADP 轉化成 ATP 的功能。由於(yu) 熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chan) 生光的反應需要 ATP 的參與(yu) ，支原體(ti) 特異性酶催化產(chan) 生的 ATP 含量，可以通過該反應轉化成生物發光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專(zhuan) 門的發光檢測儀(yi) （Luminometer）或具有發光檢測功能的多功能酶標儀(yi) 進行檢測，發光的強度與(yu)  ATP 的含量成正比。

具體(ti) 的反應如下：通過比較細胞培養(yang) 上清和未用於(yu) 細胞培養(yang) 而成分相同的培養(yang) 液二者的支原體(ti) 特異性酶的含量，即可知道培養(yang) 的細胞是否被支原體(ti) 汙染。

產(chan) 品特點

《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》具有如下顯著的優(you) 點：

1. 檢測時間短。整個(ge) 檢測過程隻需 30 分鍾左右。

2. 《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》檢測的是活支原體(ti) ，隻有樣品中存在活的支原體(ti) ，才會(hui) 生產(chan) 陽性結果，可以區分支原體(ti) 的死活。而《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》、《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》都是檢測支原體(ti) 的，不論支原體(ti) 的死活，樣品中隻要有支原體(ti) 的存在，就會(hui) 生產(chan) 陽性結果，所以無法區分支原體(ti) 的死活。細胞培養(yang) 中，最關(guan) 心的是細胞培養(yang) 液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原體(ti) 。而如果僅(jin) 有死的支原體(ti) 或者一些殘存的支原體(ti)  ，是無關(guan) 緊要的。

3. 不存在假陽性。由於(yu) 《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》、《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》都需要對支原體(ti)   進行大量的擴增，檢測過程中，隻要有微量的支原體(ti)   或者擴增產(chan) 物的汙染，就會(hui) 出現假陽性。而《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》隻檢測活的支原體(ti) ，不存在擴增產(chan) 物汙染樣品的問題。

4. 不存在因反應被抑製導致的假陰性。由於(yu) 細胞培養(yang) 數天後，培養(yang) 液中經常含有嚴(yan) 重抑製PCR擴增的代謝物， 所以使用《PCR 法支原體(ti) 檢測試劑盒》經常會(hui) 出現假陰性的問題。該問題在《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》不存在。

5. 《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》對支原體(ti) 的識別率高：由於(yu) 本試劑盒依賴的支原體(ti) 特異性酶普遍存在，其具有廣譜的識別能力。

產(chan) 品組分

（1） 支原體(ti) 檢測溶液：5.5 mL

（2） 試劑 A(已凍幹)：2.5 mL（50 次檢測）

（3） 試劑 B(已凍幹): 2.5 mL（50 次檢測）

使用方法

使用方法

1. 檢測試劑的分裝和保存

收到的產(chan) 品為(wei) 凍幹品，溶解前，請放-80 ℃冰箱低溫保存。第一次使用前，在冰上操作，分別用 2.5 mL 支原體(ti) 檢測溶液溶解試劑 A 和試劑 B（注意：因為(wei) 試劑 A 和試劑 B 的離心管容量不足 2.5 mL，可以分別先用 1 mL 支原體(ti) 檢測溶液將凍幹的試劑 A 和試劑 B 溶解後，轉移到一個(ge)  5 mL 或 10 mL 的離心管中，再各補加 1.5 mL 支原體(ti) 檢測溶液）, 按每管 50 μL 分別分裝到 50 個(ge)  1.5 mL 離心管中，立即放-80 ℃冰箱低溫保存。

2. 陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照必須使用配製完後放於(yu)  4℃冰箱，未用於(yu) 細胞培養(yang) 但成分相同的培養(yang) 液，包括其中的血清、抗生素等含量也必須相同。特別是其中的血清含量和批次，對發光的本底值影響很大，作為(wei) 陰性對照的培養(yang) 液，其中添加的血清，必須與(yu) 用於(yu) 細胞培養(yang) 的血清批次相同且含量相同。例如：如果用於(yu) 細胞培養(yang) 的培養(yang) 液為(wei) 含有 10%的胎牛血清的高糖 DMEM，那麽(me) 陰性對照也應該使用含有相同批次的 10%的胎牛血清的高糖 DMEM。如果用於(yu) 細胞培養(yang) 的培養(yang) 液為(wei) 無血清培養(yang) 液，那麽(me) 陰性對照也應該使用無

血清但成分相同的培養(yang) 液。

上述陰性對照的選取是按照嚴(yan) 格的方式進行的。如果確實沒有成分相同的培養(yang) 液，也可以使用成分接近的培養(yang) 液作為(wei) 陰性對照。如果有些樣品實在沒有合適的陰性對照或者不知道樣品原來的培養(yang) 基組成，可以嚐試使用含10%血清的 DMEM 培養(yang) 基作為(wei) 陰性對照。

3. 陽性對照的設置

如果您實驗室擁有經其他支原體(ti) 檢測方法（比如本公司的《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》或者《PCR 法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》等）檢測為(wei) 陽性的細胞係，其培養(yang)  3 天後的上清即可以直接按照後文的樣品準備方法，自己製備陽性對照。

如果您沒有上述陽性樣品，那麽(me) 陽性對照也可以從(cong) 我們(men) 公司單獨購買(mai) （貨號：LPC10）。如果第一次使用《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》，建議購買(mai) 一支本公司的《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒陽性對照》。

4. 待測樣品的準備

為(wei) 了準確判斷細胞是否有支原體(ti) 的汙染，待測的細胞培養(yang) 液樣品最好來源於(yu) 至少培養(yang)  2-3 天且匯合度在 70-90% 左右的細胞培養(yang) 液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yang) 的細胞也需要在換液傳(chuan) 代後，至少讓細胞生長 2-3 天再取培養(yang) 液進行檢測。具體(ti) 操作如下（請嚴(yan) 格按照相應的體(ti) 積進行操作）：

（1）根據濃縮倍數，可以取 180-1500 μL 上述待測樣品到 1.5 mL 離心管內(nei) ，在普通台式離心機上 1000 rpm (大約 150 g)低速離心 5 minutes，將離心後的上清轉移到另一個(ge) 離心管內(nei) （注意：轉移離心上清時，請保留底部 60 μL 左右的液體(ti) ，以防止將底部細胞沉澱吸走！），丟(diu) 棄含細胞沉澱的原有離心管。

（2）將含有上清的新的 1.5 mL 離心管，在普通台式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鍾， 沿離心管內(nei) 壁離心時的內(nei) 側(ce) 麵將離心後的上清小心緩慢全部吸走並丟(diu) 棄（注意：勿讓吸頭碰到離心管內(nei) 壁的底部 外側(ce) ，因為(wei) 底部外側(ce) 可能含有支原體(ti) 的沉澱！）。往離心管內(nei) ，加入 120 μL 作為(wei) 陰性對照的培養(yang) 液。

（3）將上述經過離心清洗一次的樣品， 再次在普通台式離心機上 16000 g （大約 13000 rpm）高速離心 5 分鍾【離心時注意保持離心管放置的方向與(yu) 上述步驟（2）相同】，同樣小心吸走 115 μL 離心後的上清並丟(diu) 棄（注意：同樣勿讓吸頭碰到離心管內(nei) 壁的底部外側(ce) 。留下大約 5 μL 培養(yang) 液的目的也是為(wei) 了防止吸頭碰到離心管底部外側(ce) 而將可能含有支原體(ti) 的沉澱吸走）。往離心管內(nei) ，加入 115 μL 作為(wei) 陰性對照的培養(yang) 液（此時，總體(ti) 積仍然為(wei)  120 μL）。

（4）將上述經過離心清洗兩(liang) 次的樣品，用移液槍上下吹吸 10-20 次，將可能含有支原體(ti) 的沉澱吹打均勻。至此，該樣品方可用於(yu) 後續的支原體(ti) 檢測（夠兩(liang) 次檢測使用）。

（5）吸取 50 μL 陰性對照、陽性對照或者已經經過低速離心去除細胞和經過高速離心替換成陰性對照的培養(yang) 液的待測樣品，放入黑色（優(you) 先選擇）或者白色不透明的 96 孔板內(nei) ，加入 50 μL 冰上放置的試劑 A，室溫反應 15 分鍾。

（6）室溫反應 15 分鍾後，加入 50 μL 冰上放置的試劑 B，無需等待，立即在具有發光檢測功能的多功能酶標儀(yi) 或者單獨的發光檢測儀(yi) （Luminometer）上，以儀(yi) 器默認的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發光檢測參數進行發光值的檢測，5 分鍾內(nei) ，連續測 5 次陰性對照和待測樣品的發光值，計算各自的平均值。

注意事項

1、 本試劑盒隻在 96 孔板進行過測試。因為(wei) 發光值會(hui) 隨時間略有變化，如果使用單管的發光檢測儀(yi) ，盡量保證陰性對照和待測樣品加入試劑 A 後的反應時間和加入試劑 B 後到發光值檢測的反應時間相同。

2、 問：如果配製完後放於(yu)  4℃冰箱未用於(yu) 細胞培養(yang) 且成分相同的培養(yang) 液本身有支原體(ti) 汙染（比如加入的血清本身含支原體(ti) ），是否仍然可以用作陰性對照？

答：可以。因為(wei) ：即使作為(wei) 陰性對照的培養(yang) 液本身有支原體(ti) 汙染，其中的含量也是極其微量的。而待測樣品是經過培養(yang)  3 天以上的，其支原體(ti) 在這 3 天培養(yang) 過程中，會(hui) 大量繁殖，用《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》檢測的發光值，肯定比陰性對照的發光值高得多。