支原體基因組提取試劑盒（離心柱法）說明書

支原體(ti) 基因組提取試劑盒（離心柱法）說明書(shu)

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬於(yu) 菲律宾新利官网开户（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優(you) 質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chan) 業(ye) 鏈中的國產(chan) 生物試劑品質關(guan) 。未來讓每一個(ge) 和我們(men) 一樣擁有民族情懷的企業(ye) ，共同創世界優(you) 秀的中國生物製造企業(ye) ，圓夢中國。

產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

《支原體(ti) 基因組  提取試劑盒》（離心柱法）（Mycoplasma Genomic Extraction Kit with Columns）的操作方法和試劑配方已經針對支原體(ti) 的特點做了優(you) 化，專(zhuan) 門用於(yu) 從(cong) 體(ti) 外培養(yang) 的細胞、細胞上 清、血清、血漿、全血、生物製品等樣品中提取支原體(ti) 基因組 。提取的支原體(ti) 基因組 可用於(yu) 《一 步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》、《PCR 法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》。

支原體(ti) 基因組  的提取有兩(liang) 個(ge) 作用：

（1）可以去除所有可能抑製 PCR 擴增的成分或者幹擾《一步法 恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》顯色的成分，保證後續 PCR 擴增的正常進行或者《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》 的顯色不被幹擾；

（2）具有濃縮支原體(ti) 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。

產(chan) 品組分

蛋白酶 K 溶液：Proteinase K（20 mg/mL） 1 mL

溶液 GR：Buffer GR 15 mL

溶液 GL：Buffer GL 15 mL

清洗液 GW1：Buffer GW1(Concentrate) 13 mL

清洗液 GW2：Buffer GW2(Concentrate) 15 mL

洗脫液 EB：Elution Buffer EB 15 mL

吸附柱：Spin Columns DM 50 個(ge)

收集管：Collection Tube 50 個(ge)  

使用方法

使用方法

1.實驗前準備及重要注意事項

1) Buffer GW1 和 Buffer GW2 的配製：第一次使用前，應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入無水乙醇，並在試劑瓶標簽中做好標記。

2) 使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉澱，如有結晶或者沉澱，請將 Buffer GL 於(yu) 56˚C 水 浴孵育重新溶解。

2. 樣品處理：本試劑盒優(you) 選體(ti) 外培養(yang) 的細胞上清（貼壁細胞直接取細胞培養(yang) 上清、懸浮培養(yang) 細胞取低速 離心後的離心上清）、血清、血漿、溶液型生物製品作為(wei) 提取支原體(ti) 基因組 的樣品。如果是粉末 型樣品，需用水溶解後，再進行後續操作。

注 1：體(ti) 外培養(yang) 的貼壁細胞培養(yang) 上清或懸浮細胞，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 5 分鍾後（切 記：此步驟離心力不能太大，否則支原體(ti) 會(hui) 被離心去除了！），取離心後上清進行檢測。

注 2：如果初始樣品是加了抗凝劑的全血，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 10 分鍾後（切記： 此步驟離心力不能太大，否則支原體(ti) 會(hui) 被離心去除了！），取上層血漿進行檢測。

注 3：如果初始樣品是未加抗凝劑的全血，待血液凝固後，取血清進行檢測。

3. 取上述細胞上清、血清、血漿、生物製品等樣品 200 μL，用移液槍吹吸均勻後，進行後續操作。

注 1：當樣品量小於(yu) 200 μL 時，加入 Buffer GR 補足至 200 μl，再進行下一步實驗。

注 2：如果預期待測樣品支原體(ti) 含量較少（比如長期低溫保存的血清、血漿、胰酶、生物製品等）， 可以取上述樣品 1 mL，加入 1.5 mL 離心管內(nei) ，13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 分鍾。吸走 離心後的上清 800 μL，剩餘(yu) 200 μL 用移液槍吹吸均勻後，進行後續操作。此步驟起濃縮支原體(ti) 的 作用，從(cong) 而提高支原體(ti) 檢測的相對靈敏度。如果需要，上述樣品的體(ti) 積可以進一步放大，經過多 次高速離心後，剩餘(yu) 200 μL 用於(yu) 後續操作（比如，如果初始體(ti) 積是 5 mL，經 5 次高速離心，取剩 餘(yu) 的 200 μL 進行後續操作，最終用 50 μL 洗脫液進行洗脫，則支原體(ti) 大約濃縮了 100 倍，支 原體(ti) 檢測的相對靈敏度也大約提高了 100 倍。）

4. 向以上溶液中加入 20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混勻。

5. 加入 200 μL Buffer GL（如果室溫較低，使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉澱，如有結晶 或者沉澱，請將 Buffer GL 於(yu) 56˚C 水浴孵育重新溶解），用吸頭充分吹吸均勻或用 Vortex 充分震蕩。

注意：不要將 Proteinase K 和 Buffer GL 進行預混，否則 Proteinase K 可能失活。

6. 將離心管放置 56˚C 水浴，孵育 15 分鍾。

注意：此步驟不能省略！

7. 加入 2 μL 支原體(ti) qPCR 內(nei) 參質粒 mycoIC2（注意：內(nei) 參質粒 mycoIC2 請吹吸均勻後，再加入。內(nei) 參質粒 mycoIC2 隻在本公司《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》內(nei) 含有，如果使用其他支原體(ti) 檢測方法，本步驟可以 跳過！）。

注 1：此步驟隻有使用本公司《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》時，需要加入支原體(ti) qPCR 內(nei) 參質粒 mycoIC2。

注 2：加入的內(nei) 參質粒 mycoIC2 用於(yu) 監控支原體(ti) 的提取和後續支原體(ti) qPCR 的擴增是否有效。

8. 加入 200 μL 無水乙醇，上下顛倒混勻數次。 l 注意：此處不能高速離心！如果需要（一般不需要離心），隻能 1000 rpm（約 100 g）低速短暫 離心（20 Sec），使管壁和壁蓋上的液體(ti) 集中到管底。

9. 用 1 mL 吸頭將所得溶液全部（含管壁和蓋子上溶液）加入到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM） 中。12,000 rpm 離心 1 分鍾，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW1（使用前檢查是否加入無水乙醇!）,蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒 一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鍾，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛 倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鍾，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。

12.再次清洗：向吸附柱中加入 600 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鍾，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。

13.繼續 12,000 rpm 離心 2 分鍾。離心後，在亮光下，仔細檢查吸附柱內(nei) 部吸附膜上方的塑料墊圈四周是 否有液體(ti) 殘留。如果發現吸附柱內(nei) 部塑料墊圈四周有液體(ti) 殘留，可以將吸附柱放回收集管內(nei) ，將有液 體(ti) 殘留的一側(ce) 放在離心力內(nei) 側(ce) ，繼續 12,000 rpm 離心 1 分鍾。

14.離心後，經仔細檢查，如果確認吸附柱內(nei) 部塑料墊圈四周沒有液體(ti) 殘留，則可以丟(diu) 棄收集管，將吸附柱 置於(yu) 一個(ge) 新的 1.5 mL 離心管（自備）中，打開吸附柱蓋子，置於(yu) 50-65℃的烘箱內(nei) 放置至少 15 分鍾， 以讓吸附膜中的乙醇揮發幹淨（請務必放在 50-65℃的烘箱內(nei) 放置！如果室溫放置，不僅(jin) 時間需要 延長，還不排除有些樣品由於(yu) 乙醇揮發不幹淨，影響後續 PCR 擴增效率，甚至失敗）。

注意：打開吸附柱蓋子，將吸附柱放在 50-65℃的烘箱內(nei) 至少 15 分鍾，此步驟非常關(guan) 鍵！如果沒 有烘箱，強烈建議購買(mai) 一個(ge) 。這一步的目的是將吸附膜中殘餘(yu) 的乙醇去除，乙醇的殘留會(hui) 嚴(yan) 重影響後續的酶促反應（如：酶切、PCR 擴增等），甚至可能導致後續的 PCR 失敗。

15.向吸附柱的中間部位懸空加入 50 μL Elution Buffer EB，室溫放置 3 分鍾，12,000 rpm 離心 1 分鍾， 收集 溶液，-20℃保存。

運輸及保存方法

該產(chan) 品常溫運輸，室溫保存（收貨後，其中的 Proteinase K 放-20˚C 保存）。該條件下，至少 3 年內(nei) 有 效。Proteinase K 溶液可以在室溫保存 2-3 個(ge) 月，長期保存需要放-20˚C。