點突變試劑盒1.0說明書

點突變試劑盒1.0說明書(shu)

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬於(yu) 菲律宾新利官网开户（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優(you) 質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chan) 業(ye) 鏈中的國產(chan) 生物試劑品質關(guan) 。未來讓每一個(ge) 和我們(men) 一樣擁有民族情懷的企業(ye) ，共同創世界優(you) 秀的中國生物製造企業(ye) ，圓夢中國。

產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

本試劑盒可以在質粒序列中任意位點引入特定的定突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

首先用高保真聚合酶與(yu) 帶有突變堿基與(yu) 硫代修飾的引物，PCR擴增野生型質粒，將質粒線性化並引入突變位點，然後用化學重組試劑將質粒重組成環狀質粒。擴增質粒的一對引物各自5'末端的10-12個(ge) 堿基互補配對，用於(yu) 重組環化質粒。將帶有突變堿基的線性化質粒PCR產(chan) 物用化學重組試劑處理環化質粒，然後進行DH5a轉化，完成基因定點突變。

本公司化學法突變試劑盒含有高保真聚合酶2XPCR Mix、化學重組試劑，可以從(cong) 頭到尾完成整個(ge) 實驗，極大的方便了實驗操作。另有無高保真聚合酶2XPCR Mix的化學法突變試劑盒。

產(chan) 品特點

定點突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

產(chan) 品組分

使用方法

使用方法

01. 設計突變引物

引物設計總原則：在正反向擴增引物的5'端引入末端互補同源序列，使擴增後的線性化質粒片段5'和3'末端帶有10-12個(ge) 堿基的同源序列，用於(yu) 重組環化質粒。

l 正向擴增引物設計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性正向配對序列-3'

l 反向擴增引物設計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性反向配對序列-3'

l 正／反向擴增引物與(yu) 質粒模板的特異性配對序列Tm值55-65℃為(wei) 佳，末端同源區序列長度為(wei) 10-12 個(ge) 堿基（一般情況同源區10個(ge) 堿基足以）。

l 一般引物不需PAGE純化，如果最終引物長度超過40 bp，推薦合成時選用PAGE純化，有助於(yu) 提高PCR與(yu) 點突變成功率。

02. 反向PCR擴增線性化質粒，並引入突變位點

為(wei) 了防止突變位點之外的堿基額外突變，確保使用高保真聚合酶進行反向PCR。50ul的PCR體(ti) 係中，推薦使用1-5ng 環狀質粒模板。限製性內(nei) 切酶DpnI處理PCR產(chan) 物，可以降低野生型質粒形成的克隆數。由於(yu) 本突變試劑盒效率高，可省略DpnI消化處理，對突變成功率影響不大。

03. 重組環化反應的線性化質粒使用量

無需精確計算化學法重組反應的線性化質粒PCR產(chan) 物加入量，一般使用3-5ul。

04. 質粒重組環化反應

（1）室溫配製以下反應體(ti) 係：

組分            重組反應^a     陰性對照^b       陽性對照^c

線性化質粒       X μl           X μl              5 μl

化學重組試劑     2 μl           0 μl              2 μl

ddH₂0         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割膠純化的PCR產(chan) 物進行重組反應時，一定在重組反應體(ti) 係中加入1/10體(ti) 積的化學重組Buffer

b. 用來確認野生型環狀質粒殘留，推薦進行。

c. 突變線性質粒陽性對照反應可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響。

（2）輕柔混勻後，在70℃反應8-10 min，置於(yu) 室溫或冰上冷卻。

u 在PCR儀(yi) 及其它加熱儀(yi) 器上進行反應，重組環化效率在反應8-10 min左右達到最高。

u 重組環化產(chan) 物可於(yu) -20℃存放1個(ge) 月，待需要時解凍轉化即可。

05．重組環化質粒產(chan) 物轉化

u 在冰上解凍克隆感受態細胞，冰上放置15min

u 取5ul重組環化產(chan) 物加入到50ul感受態細胞中，輕彈管壁混勻(請勿振蕩混勻)，冰上靜置15-20 min。重組產(chan) 物轉化體(ti) 積最多不應超過所用感受態細胞體(ti) 積的1/5；

u 42℃水浴熱激1-2min後，立即置於(yu) 冰上冷卻1- 2 min。

u 加入450 μl SOC或LB培養(yang) 基(不添加抗生素)，37℃搖菌30min-1h (轉速200 - 250 rpm)。

u 將相應抗性的LB平板固體(ti) 培養(yang) 基在37℃培養(yang) 箱中預熱30min（可省略）。

u 直接吸取20-100ul菌液到含有正確抗性的平板上，用無菌塗布棒塗勻。

37℃培養(yang) 箱中倒置培養(yang) 12 - 16 h。

06．點突變測序鑒定

u 過夜培養(yang) 後，重組環化反應轉化平板上形成數百個(ge) 單克隆，而不加化學重組試劑的陰性對照反應轉化平板上的克隆數應顯著少於(yu) 前者。

u 挑取重組反應轉化平板上2-3個(ge) 克隆進行序列測定，驗證是否突變成功。

注意事項

為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作！

本產(chan) 品主要用於(yu) 科研領域，不宜用於(yu) 臨(lin) 床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

幹冰運輸。-20℃保存，有效期2年。