KOD-Plus-Neo產品說明書

KOD-Plus-Neo是基於(yu) 一種ji端嗜熱的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的聚合酶。這種聚合酶由於(yu) 其高效的3’-5’核酸外切酶活性（校對活性）。該產(chan) 品含有一種du特的“延伸增強劑"，可抑製傳(chuan) 統PCR產(chan) 生的“平台效應"。因此，與(yu) 先前版本的KOD-Plus（KOD-201）相比，該試劑表現出更高的擴增效率和延伸能力。此外，這種酶對於(yu) PCR延伸步驟僅(jin) 需要30秒/kb。這有利於(yu) 長片段PCR。這種酶含有兩(liang) 種抑製聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD 聚合酶抗體(ti) 和，從(cong) 而支持熱啟動PCR。

產(chan) 品特點

Ø 比普通菲律宾新利网上娱乐 聚合酶高80倍的PCR保真度。

Ø 與(yu) 傳(chuan) 統PCR相比，“延伸增強劑"能夠實現更高的擴增效率和延伸能力。

Ø PCR延伸步驟隻需要30秒/kb。

Ø 兩(liang) 步循環條件可用於(yu) 使用≥20 mer引物的擴增（退火溫度，Tm>63°C）。

產(chan) 品組分

引物設計

Ø 引物應為(wei) 22-35個(ge) 堿基，Tm>63℃

Ø 引物的最佳GC含量為(wei) 45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分別為(wei) 60-70%和40-50%。

Ø 長片段擴增的引物應為(wei) 25-35個(ge) 堿基，Tm>65°C。

Ø 不能使用含有肌苷的引物

Ø 建議使用最近鄰法計算引物的Tm。本手冊(ce) 中的Tm值是使用以下參數使用該方法計算的。Na⁺濃度：50 mM 寡核苷酸濃度：0.5 µM

PCR產(chan) 物的克隆

Ø KOD-Plus-Neo由於(yu) 其3’-5’核酸外切酶活性。因此，PCR產(chan) 物為(wei) 平端產(chan) 物，可以根據平端克隆方法進行克隆。

Ø KOD-Plus-Neo的PCR產(chan) 物應在限製性內(nei) 切酶處理之前進行純化。KOD 聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反應結束時仍然存在。

Ø 克隆KOD 聚合酶產(chan) 生的平端PCR產(chan) 物推薦專(zhuan) 用TA克隆試劑盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"

實驗步驟

1. 標準反應體(ti) 係配置

反應物準備前，除酶溶液外，所有成分均應wan全解凍。

**不要使用其它試劑盒或其它公司的dNTP

注意：

最佳引物濃度為(wei) 0.3 µM。在長片段（≥10kb）的情況下，降低引物濃度（0.15µM）可能會(hui) 產(chan) 生更有效的擴增。

二甲基亞(ya) 碸DMSO（終濃度2-5%）的添加有利於(yu) 擴增富含GC的靶標。在DMSO存在的情況下，PCR保真度不會(hui) 降低（參見步驟2，循環條件）。

c或基因組中的汙染RNA會(hui) 通過螯合Mg2+來抑製PCR反應。應使用<200 ng RNA的模板進行PCR。

模板的質量應通過電泳檢查。模板的長度和純度會(hui) 影響擴增結果。

含有尿嘧啶的模板不能用於(yu) 擴增。

對於(yu) PCR反應，建議使用薄壁管。建議總反應體(ti) 積為(wei) 50 μL。

2. 循環條件

推薦≥20 mer的引物，Tm>63°C的兩(liang) 步循環條件用於(yu) 有效擴增。

兩(liang) 步循環：

如果引物的Tm值超過63°C，建議采用兩(liang) 步循環。

注意：

對於(yu) 使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chan) 率。

二甲基亞(ya) 碸DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利於(yu) 擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應根據引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

如果擴增失敗，可能需要3步循環

三步循環：

當引物的Tm小於(yu) 63℃時，應使用三步循環。

注意：

對於(yu) 使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chan) 率。

二甲基亞(ya) 碸DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利於(yu) 擴增富含GC的片段。

降落PCR：

如果在2步和3步循環條件下觀察到非特異性擴增（在PCR產(chan) 物電泳後觀察到額外的條帶），降落PCR則可以提高特異性。

注意：

對於(yu) 使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chan) 率。

二甲基亞(ya) 碸DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利於(yu) 擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應根據引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

應用實例

性能數據：

1. PCR保真度

用TArget克隆技術對從(cong) 人基因組中擴增的人β-珠蛋白基因產(chan) 物進行序列分析，測定突變頻率。KOD-Plus-Neo表現出ji好的保真度，突變頻率與(yu) 以前版本的酶（KOD-Plus-）相同。

2. 延伸能力

根據每種酶的推薦條件，通過幾種PCR酶從(cong) 人類基因組中擴增出各種大小的片段。KOD-Plus-Neo成功擴增了17.5 kb的片段。

3. 低拷貝模板擴增

使用0.5 ng c模板擴增四個(ge) 基因。模板由HeLa細胞的總RNA合成。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有基因。

4. 延伸速度

不同的擴增時間從(cong) 人類基因組（50ng）中擴增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延長時間擴增3.6 kb的靶標。

應用數據：

1. 各種蛋白激酶片段的擴增

利用HeLa細胞總RNA合成的c擴增各種蛋白激酶開放閱讀框。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有片段。

2. 長片段擴增

使用不同濃度的引物從(cong) 人類基因組中擴增長片段。過多的引物會(hui) 抑製擴增。因此，應使用約0.15 µM的較低引物濃度擴增長片段（>10 kb）。

常見問題及解決(jue) 辦法

參考文獻

1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).

2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).

3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).

4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).

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