淋巴細胞分離簡述
作為(wei) 一種重要的免疫細胞，淋巴細胞的數目及功能狀態反應了機體(ti) 所處的免疫狀態，與(yu) 一些先天或後天的免疫缺陷性疾病、傳(chuan) 染性疾病以及惡性腫瘤等免疫功能障礙有關(guan) 的疾病有密切關(guan) 聯。因此，研究淋巴細胞的免疫狀態對多種疾病的診斷、預防及治療都有著極為(wei) 重要的意義(yi) 。而淋巴細胞分離是研究淋巴細胞功能狀態及其在細胞免疫中作用的關(guan) 鍵步驟。
淋巴細胞分離來源主要是外周血（或淋巴組織細胞懸液），目前常規的淋巴細胞分離方法有基於(yu) 淋巴細胞分離液的密度梯度離心法、HES沉降法、以及基於(yu) 抗原抗體(ti) 結合的磁珠與(yu) 流式細胞分離法。本文就現在常用的幾種淋巴細胞分離方法及其特點做一簡要綜述。
1、密度梯度離心法
該方法采用淋巴細胞分離液進行進行密度梯度離心分離得到淋巴細胞。外周血單個(ge) 核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞，其體(ti) 積、形狀和比重與(yu) 其他細胞不同從(cong) 而導致各種細胞具有不同的密度，淋巴細胞分離液即是一種根據細胞密度差異，借助離心產(chan) 生的重力加速度，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從(cong) 而將各種血細胞加以分離純化的常用試劑。常用的淋巴細胞分離液有Ficoll淋巴細胞分離液和Percoll淋巴細胞分離液。
1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度離心法
Ficoll是一種中性的蔗糖的多聚體(ti) ，吸水性強，平均分子量為(wei) 400,000，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。單一的Ficoll溶液分子量大，高濃度時增加粘度易導致細胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴細胞分離液采用了降低Ficoll濃度，同時加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近於(yu) 等滲，適用於(yu) 分離外周血淋巴細胞和單個(ge) 核細胞（PBMC，外周血淋巴細胞和單個(ge) 核細胞比重為(wei) 1.075左右）【1】。利用該分離液作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細胞與(yu) 粒細胞由於(yu) 密度較大故沉於(yu) 分層液的底部，淋巴細胞和單核細胞（PBMC）的比重與(yu) 分層液比重相近，故位於(yu) 分層液界麵上。【2，3】
Ficool淋巴細胞分離液是一種經典的淋巴細胞分離試劑，分離得到的PBMC純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故隻適用於(yu) PBMC、脊髓幹細胞、骨髓幹細胞的分離。
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MP Biomedicals Lymphocyte Separation Medium - LSM™ 0850494X 100 mL
biomarket LymphoprepTM分離液 1114544 250ml
1.2. Percoll密度梯度離心法：
Percoll成分為(wei) 矽化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的顆粒，滲透壓很低，粘度也很小，不穿透生物膜，對細胞無毒害無刺激，不引起細胞聚集，可形成高達1.3g／ml密度。特別的是percoll的顆粒直徑大小不同，可在離心過程中自然形成連續的密度梯度，從(cong) 而將不同密度的細胞分離出來。而且Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定，配置不同濃度（密度）時僅(jin) 需通過用PBS(1x)或組織培養(yang) 液稀釋即可獲得，廣泛用於(yu) 分離細胞、亞(ya) 細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與(yu) 完好的活細胞分離。采用Percoll細胞分離液得到的細胞可直接用於(yu) 基於(yu) 熒光標記的細胞分選。【4】
因此，Percoll細胞分離液不僅(jin) 適用於(yu) 外周血中PBMC的分離（單個(ge) 核細胞和淋巴細胞分別處於(yu) 不同的密度層），而且能將全血中的多種細胞分離出來（各種細胞處於(yu) 相應的梯度層），還可根據不同實驗室需要配置所需的連續密度梯度，分離特定的細胞或亞(ya) 細胞組分。初步分離得到的PBMC可根據需要不同密度梯度的不連續梯度離心方法進行進一步細胞純化，如純化淋巴母細胞和除去死細胞以及富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化。【5】
常用percoll濃度密度換算（Percoll原液與(yu) 10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為(wei) 100％ Percoll，比重是1.127）
Percoll濃度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
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GE 17-0891-01 1 L
GE 17-0891-01 100 ml
1.3. Iodixanol梯度離心法
Iodixanol是一種化學成分為(wei) 碘海醇（Iohexo1）的白色、高親(qin) 水性粉劑，可以配成型的非離子密度梯度分離液。分子量為(wei) 821，密度為(wei) 2.1 g/ml，是非離子型的、對細胞無毒性的化合物，可用於(yu) 細胞、細胞器、生物大分子、病毒等各種生物物質的分離或提純【6】。該分離液的密度可以通過測定其折射率來確定，配置後可以進行高溫高壓的滅菌。可根據需要配置成不同密度的梯度離心液，主要用於(yu) 脂蛋白的分離，也可用於(yu) 淋巴細胞分離純化。【7,8】
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Axis-Shield Nycodenz（粉劑） AS1002424 1x500g
Axis-Shield LymphoprepTM 分離管（即用型） AS1019818 18Tubes x10ml
Axis-Shield OptiPrepTM 分離液（即用型）AS1114542 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114544 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114545 4x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114547 1x500ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114547 6x500ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分離液（即用型）AS1114550 4x250ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分離液（即用型）AS1114551 1x250ml
2、羥*基澱粉（HES）離心沉澱法
HES是一種由高分子量支鏈澱粉經降解、羥*基化並進一步加工處理後製成的血漿代用品【9】。自然狀態下，HES與(yu) 紅細胞膜上的負電荷結合，使紅細胞彼此以凹麵相貼聚集而下沉，與(yu) 血漿及單個(ge) 核細胞形成清晰的界麵。如果HES與(yu) 外周血混合物經低速離心可加快紅細胞的下沉，便於(yu) 吸取含單核細胞層，使PBMC的分離過程簡單化。該方法分離PBMC操作簡便，成本低廉，分離細胞數量與(yu) 密度梯度離心方法相當。然而該方法分離的細胞質量有待進一步提高。【10-12】
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國內(nei) 多家血漿代用品供應商如湖北武漢康寶泰精細化工有限公司可以獲得。
3、基於(yu) 免疫技術的淋巴細胞分離法
目前多家生物製品公司均開發出的基於(yu) 抗原抗體(ti) 特異性結合的淋巴細胞分離試劑盒，主要有免疫磁珠分離法、流式細胞分選法【13,14】。這些試劑盒能特異性分離外周血或其它組織中的單一淋巴細胞類型，操作簡便，所得細胞純度高，可直接用於(yu) 下遊分子生物學實驗。然而該法基於(yu) 抗體(ti) 技術，因此成本高，還未成為(wei) 目前的主流淋巴細胞分離方法。
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Stem cell EasySep™ Magnet全淋巴細胞富集試劑盒 19961HLA
Stem cell EasySep™ MagnetT細胞富集試劑盒 19951HLA
Stem cell EasySep™ MagnetB細胞富集試劑盒 19954HLA
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主要參考文獻：
1. Separation of human lymphocytes from citrated blood by density gradient (NycoPrep) centrifugation: monocyte depletion depending upon activation of membrane potassium channels. Bøyum A, Brincker Fjerdingstad H, Martinsen I, Lea T, Løvhaug D. Scand J Immunol. 2002 Jul;56(1):76-84.
2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.
3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.
Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.
4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3
5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.
Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.
6. Iodixanol梯度離心法分離脂蛋白. 黨(dang) 美林，林元喜. 《第七屆海峽兩(liang) 岸心血管科學研討會(hui) 論文集》.2009年
7. Su-Ting Chen, Jia-Yun Li, Yi Zhang. Recombinant MPT83 Derived from Mycobacterium tuberculosis Induces Cytokine Production and Upregulates the Function of Mouse Macrophages through TLR2. The Journal of Immunology, 2012, 188: 668–677
8.Xingui Tian, Xiaobo Su, Xiao Li. Protection against Enterovirus 71 with Neutralizing Epitope Incorporation within Adenovirus Type 3 Hexon. PLoS ONE. July 2012,Volume 7, Issue 7 , e41381.
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14. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Dagur PK, McCoy JP Jr. Curr Protoc Cytom. 2015 Jul 1;73:5.1.1-5.1.16
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